Activación de GPCR de clase B1 por un agonista intracelular

Naturaleza (2023)Citar este artículo

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Los receptores acoplados a proteína G (GPCR) generalmente acomodan ligandos específicos en los bolsillos de unión ortostérica. La unión del ligando desencadena un cambio conformacional alostérico del receptor que conduce a la activación de transductores intracelulares, proteínas G y β-arrestinas. Debido a que estas señales a menudo inducen efectos adversos, debe dilucidarse el mecanismo de activación selectiva de cada transductor. Por lo tanto, se han desarrollado muchos agonistas con polarización ortostérica, y los agonistas con polarización intracelular han despertado recientemente un amplio interés. Estos agonistas se unen dentro de la cavidad intracelular del receptor y preferentemente sintonizan la vía de señalización específica sobre otras vías de señalización, sin reordenamiento alostérico del receptor desde el lado extracelular1,2,3. Sin embargo, actualmente solo están disponibles estructuras unidas a antagonistas1,4,5,6, y no hay evidencia que respalde que la unión agonista sesgada se produzca dentro de la cavidad intracelular. Esto limita la comprensión del agonismo sesgado intracelular y el desarrollo potencial de fármacos. Aquí informamos la estructura de microscopía electrónica criogénica de un complejo de Gs y el receptor de hormona paratiroidea humana tipo 1 (PTH1R) unido a un agonista de PTH1R, PCO371. PCO371 se une dentro de un bolsillo intracelular de PTH1R e interactúa directamente con Gs. El modo de unión a PCO371 reorganiza la región intracelular hacia la conformación activa sin propagación de señal alostérica inducida extracelularmente. PCO371 estabiliza la conformación significativamente doblada hacia afuera de la hélice transmembrana 6, lo que facilita la unión a las proteínas G en lugar de las β-arrestinas. Además, PCO371 se une dentro del bolsillo intracelular altamente conservado, activando 7 de los 15 GPCR de clase B1. Nuestro estudio identifica un bolsillo de unión a agonista intracelular nuevo y conservado y proporciona evidencia de un mecanismo de señalización sesgado que se dirige a la interfaz receptor-transductor.

Los GPCR comprenden la familia más grande de proteínas humanas y están involucrados en casi todos los procesos fisiológicos. En consecuencia, son el objetivo de más del 30% de los fármacos comercializados7. Los agonistas se unen a un bolsillo extracelular de unión ortostérica de GPCR, lo que induce cambios conformacionales y estabiliza la conformación activa del dominio transmembrana (TMD). Los bolsillos ortostéricos han desarrollado formas y secuencias muy diversas, lo que permite responder a una serie de estímulos extracelulares8. Además de los agonistas ortostéricos, se han generado numerosos moduladores alostéricos y estudios estructurales previos han identificado varios bolsillos alostéricos9. En comparación con los sitios ortostéricos, los sitios alostéricos tienden a tener una mayor variedad de residuos de aminoácidos; por lo tanto, los ligandos alostéricos proporcionan especificidad de subtipo para los receptores. Aunque estudios estructurales previos han revelado modos de reconocimiento precisos y específicos para ligandos ortostéricos y alostéricos por parte de receptores individuales, aún no se han descubierto bolsillos de unión de agonistas conservados en distintos subtipos de receptores10.

La mayoría de los agonistas activan múltiples vías de señalización y, en ocasiones, algunas de estas señales inducen efectos farmacológicos adversos. Los agonistas sesgados, que preferentemente activan un transductor intracelular específico, tienen el potencial de maximizar el impacto terapéutico al tiempo que reducen los efectos adversos10. Los agonistas sesgados actuales comúnmente se unen a la mitad extracelular del TMD, mientras que los agonistas que se unen al lado intracelular, particularmente en la interfaz receptor-transductor, pueden ser preferibles para la modulación precisa de la acción de señalización sesgada2. Hasta el momento, se han informado seis estructuras de GPCR unidos a ligandos intracelulares1,4,5,6,11,12. Sin embargo, la mayoría de estos son estructuras unidas a antagonistas, y no hay evidencia estructural de que los agonistas sesgados se unan a un bolsillo del transductor intracelular1,4,5,6. Esta falta de conocimiento limita la capacidad de comprender y afinar este agonismo sesgado intracelular.

PTH1R es un GPCR de clase B1 y es un importante regulador de la homeostasis de iones minerales y el metabolismo óseo. El PTH1R responde a los ligandos de la hormona paratiroidea (PTH) y del péptido relacionado con la hormona paratiroidea (PTHrP) y activa Gs, Gq y β-arrestinas13. Las formas naturales y modificadas de estos ligandos inducen una formación ósea anabólica sustancial y se utilizan para el tratamiento clínico de la osteoporosis14,15. Sin embargo, estos ligandos también inducen la reabsorción ósea catabólica, lo que provoca efectos adversos. El equilibrio entre efectos terapéuticos y adversos depende de las diferencias en la duración de la producción de AMP cíclico mediada por Gs16. La activación de Pulse Gs en la membrana plasmática induce la producción transitoria de AMPc. Por el contrario, el PTH1R activado es internalizado por las β-arrestinas e induce la producción sostenida de AMPc en el endosoma temprano, lo que provoca efectos adversos. Por lo tanto, los agonistas sesgados por la proteína G son útiles en el tratamiento de la osteoporosis; sin embargo, los mecanismos de activación sesgada por la proteína G se desconocen en gran medida en PTH1R.

Anteriormente informamos sobre las estructuras de los complejos PTH y PTHrP-PTH1R-Gs, lo que brinda información estructural sobre por qué ocurren los efectos adversos17. Aunque esta información es crucial para el desarrollo de fármacos basados ​​en péptidos que se dirijan a PTH1R, los péptidos deben administrarse mediante inyección subcutánea, y los agonistas no peptídicos y administrados por vía oral son deseables para reducir la carga física de los pacientes. Recientemente, se demostró que PCO371, un agonista químico no peptídico de PTH1R, exhibe actividad mimética de PTH in vivo a través de la administración oral18. Sin embargo, no hay información estructural para PTH1R unido a PCO371; por lo tanto, queda por dilucidar el sitio de unión y el mecanismo de activación de PCO371.

Para dilucidar cómo PCO371 se une a PTH1R e induce su reordenamiento conformacional, determinamos la estructura del complejo de señalización PCO371-PTH1R-Gs. PTH1R se expresó en células HEK293, se solubilizó en una solución de lauril maltosa neopentil glicol (LMNG) con hemisuccinato de colesterilo (CHS) y se purificó en glicodiosgenina (GDN) con la solución de CHS en presencia de PCO371. Utilizamos una solución de pH 9,0 durante la purificación debido a los requisitos de solubilidad de PCO371 a altas concentraciones (Métodos). PCO371 aumentó significativamente la actividad de Gs en condiciones levemente básicas (pH 9,0), mientras que la activación de Gs inducida por PTH fue equivalente tanto a pH fisiológico (pH 7,4) como a pH 9,0 (datos ampliados, figura 1). El PTH1R unido a PCO371 se mezcló con el heterotrímero mini-Gs diseñado y el nanocuerpo 35 (Nb35) para formar un complejo PCO371-PTH1R-mini-Gs estabilizado con Nb35. Después de la purificación, se tomaron imágenes de este complejo de señalización usando un microscopio electrónico de transmisión criogénica Titan Krios G4 con un detector K3. Las imágenes de partículas se clasificaron por clasificaciones 2D y 3D y luego se usaron para crear un mapa de densidad de microscopía electrónica criogénica (crio-EM) con una resolución global de 2.9 Å (Fig. 1a, Datos extendidos Fig. 2 y Tabla de datos extendidos 1). Este mapa primario permitió la asignación inequívoca de la estructura secundaria y las orientaciones de la cadena lateral del complejo PCO371-PTH1R-Gs, excepto el dominio extracelular de PTH1R (Fig. 1b y Extended Data Fig. 3). No se observó una densidad clara correspondiente al dominio extracelular, lo que contrastaba con la estructura del complejo PTH-PTH1R-Gs previamente determinada y varias estructuras del complejo receptor 1 del péptido similar al glucagón unido a un agonista químico pequeño (GLP-1R)-Gs ( Datos extendidos Fig. 4a,b). Esta diferencia estructural indica que el dominio extracelular es altamente flexible y no requiere un estado conformacional específico para permitir el acoplamiento de Gs con PTH1R.

a, Vistas ortogonales del complejo PCO371–PTH1R–Gs, construidas a partir del mapa de potencial crio-EM y coloreadas según la subunidad. violeta, PTH1R unido a PCO371; magenta, PCO371; amarillo, dominio similar a mini-Gαs Ras; tomate, Gβ1; azul marino, Gγ2; azul polvo, Nb35. b, Mapa de densidad y modelo construido de PCO371 cerca del bolsillo de unión de PCO371. c, Vista de primer plano del sitio de unión a PCO371. Los superíndices numéricos indican posiciones relativas en el receptor de acuerdo con la numeración GPCR de clase B1 de Wootten de la región TMD del receptor33. El mapa se muestra en el nivel de contador 2.085 e A–3. d, Estructura química de PCO371. PCO371 se compone de cuatro grupos químicos (que se muestran de izquierda a derecha): trifluorometoxifenilo, espiroimidazolona, ​​dimetilfenilo y DMH.

En particular, el complejo PTH1R carecía de cualquier densidad de ligando aparente en el bolsillo de unión ortostérica, cuyas características no se informaron previamente para la mayoría de las otras estructuras GPCR de clase B1 unidas a agonistas19 (Datos extendidos Fig. 4b). En cambio, observamos una densidad clara correspondiente a PCO371 en un bolsillo de unión al transductor intracelular formado por la hélice transmembrana 2 (TM2), TM3, TM6 y TM7, que estaba espacialmente separado del bolsillo ortostérico extracelular (Fig. 1a-c y extendido). Datos Fig. 4b). La mayoría de los contactos ligando-receptor estuvieron mediados por van der Waals e interacciones hidrofóbicas, de acuerdo con la naturaleza hidrofóbica de PCO371 (Tabla 2 de datos ampliados). En particular, Tyr4597.57 (los números en superíndice reflejan la numeración GPCR de clase B1 de Wootten) formó enlaces de hidrógeno con el grupo carbonilo de la cadena principal de Val4126.44 y PCO371, que estabiliza el complejo PCO371-PTH1R-Gs (Fig. 1c). Además, la cadena lateral de Tyr4597.57 secuestró PCO371 de los lípidos de la membrana (Fig. 1a, b). El grupo carbonilo de dimetilhidantoína (DMH) en PCO371 formó un puente salino con Arg2192.46 (Fig. 1a, c, d). En particular, el grupo DMH de PCO371 (Fig. 1d) interactuó con el gancho carboxi-terminal de Gαs, que empaquetó firmemente PCO371 en el núcleo del receptor (Fig. 1a, d). Estas interacciones son consistentes con los hallazgos de nuestro estudio anterior de la relación estructura-actividad química, que reveló que la ausencia del grupo PCO371 DMH condujo a una disminución significativa en la potencia20,21. Nuestras observaciones estructurales, junto con los hallazgos previos de la relación estructura-actividad química, sugieren que PCO371 es un agonista que se une a Gs y la cavidad intracelular del receptor.

Para caracterizar la estructura general del complejo PCO371-PTH1R-Gs, comparamos esta estructura con las de PTH-PTH1R-Gs y PTH1R17,22 unida a PTH diseñada (ePTH). La estructura PTH1R unida a PTH poseía las características distintivas de las estructuras activas de GPCR de clase B1. En resumen, la porción extracelular de esta estructura exhibió el movimiento hacia adentro de TM1, TM7 y el tercer bucle extracelular, así como el movimiento hacia afuera de TM6, lo que indujo el movimiento significativo hacia afuera de TM6 en la porción intracelular. Por el contrario, la estructura de PTH1R unida a ePTH, la única estructura de PTH1R de tipo inactivo, exhibió conformaciones inactivas en el núcleo de TMD y la porción intracelular, aunque la porción extracelular se desplazó ligeramente hacia una conformación activa debido a la unión de un agonista diseñado (Fig. 2a, b).

a, Superposición de complejos PCO371–PTH1R–Gs y PTH–PTH1R–Gs (clase 2, una forma activa representativa), alineados en TM2–TM5. Los símbolos de ojo y flecha indican los ángulos de visión en b y c. b,c, vistas extracelulares (b) e intracelulares (c) de los TMD superpuestos de PTH1R activo unido a PCO371, PTH1R activo unido a PTH y PTH1R inactivo unido a ePTH. b, Las flechas bidireccionales indican las distancias de los átomos de Cα de los residuos Thr1921.44 (TM1), Ile4226.54 (TM6) y Met4457.43 (TM7) entre las estructuras de PTH1R unido a PCO371 y PTH1R activo unido a PTH, o entre las estructuras de PTH1R de tipo inactivo unido a PCO371 y unido a ePTH. c, La flecha unidireccional indica el movimiento hacia afuera típico de TM6 en PTH1R unido a PCO371 y PTH1R unido a PTH. d, Mecanismo de unión competitivo alostérico de PCO371 y PTH. PTH y PCO371 chocan en los círculos discontinuos con la otra conformación unida al ligando. e, Estructuras superpuestas de PTH1R unido a PTH, PTH1R unido a PCO371, GPCR de clase B1 inactivos o similares a inactivos (PTH1R, GCGR, GLP-1R y CRF1R), y todas las demás estructuras de GPCR de clase B1 unido a agonista endógeno (PTH2R, SCTR, GHRHR, PAC1R, VIP1R, VIP2R, GCGR, GIPR, GLP-1R, GLP-2R, CALCR, CALRL, CRF1R y CRF2R). El ángulo se muestra entre los átomos de Cα de los residuos Ile/Met/Val6.54, Gly6.50 y Val/Ala/Leu6.39 en TM6. Tenga en cuenta que el ángulo de PTH1R unido a PCO371 se calcula entre Leu6.39, Pro6.47 e Ile6.54 debido a la torcedura en Pro6.47.

Las comparaciones entre las estructuras de las estructuras PCO371–PTH1R–Gs, PTH–PTH1R–Gs y PTH1R unido a ePTH revelaron la conformación distinta del estado activo inducido por PCO371. Primero, las porciones extracelulares de TM1, TM6 y TM7 en PTH1R unido a PCO371 se desplazaron aproximadamente 6 Å hacia afuera, 6 Å hacia adentro y 4 Å hacia afuera, respectivamente, en comparación con la estructura PTH1R activa unida a PTH (Fig. 2a, b). Estas porciones de TM1 y TM7 se movieron más hacia afuera, y la porción de TM6 se movió más hacia adentro en comparación con el PTH1R unido a ePTH. Estos movimientos son consistentes con el cambio conformacional inactivo-activo caracterizado previamente en las estructuras GPCR de clase B119,22,23,24,25 (Fig. 2b y Fig. 5a extendida), lo que indica que las porciones extracelulares del TMD adoptan la conformación inactiva en la estructura PTH1R unida a PCO371. En contraste con la porción extracelular, la porción intracelular de TMD en PTH1R unido a PCO371 exhibió el movimiento hacia afuera de TM6, que es similar al movimiento en la estructura PTH-PTH1R-Gs activa (Fig. 2c). Esta conformación extracelular distintiva hizo que TM6 se desenrollara y se doblara moderadamente (aproximadamente 145°) en la estructura PTH1R unida a PCO371, que es distinta de la TM6 fuertemente doblada (aproximadamente 90°) en la estructura PTH1R unida a PTH (datos extendidos Fig. 5b). La superposición de las estructuras PTH1R unida a PCO371 y PTH1R unida a PTH reveló que PCO371 chocaba espacialmente con la conformación TM6 fuertemente torcida en PTH1R unido a PTH (Fig. 2d). Además, la conformación TM6 moderadamente retorcida de PTH1R unido a PCO371 chocó espacialmente con el extremo amino de PTH en la estructura de PTH1R unido a PTH (Fig. 2d), de acuerdo con experimentos previos de competencia de ligandos18. La superposición de estructuras de GPCR de clase B1 activa reveló los ángulos de torcedura en su mayoría idénticos de TM6 (aproximadamente de 90° a 100°) en estructuras de GPCR de clase B1 activa unidas a agonistas endógenos o químicos (Fig. 2e, izquierda, y datos extendidos Fig. 5c, arriba y medio). Por lo tanto, la torcedura moderada (aproximadamente 145 °) en TM6 causada por la unión de PCO371 es distinta de otras estructuras activas, y el ángulo es intermedio entre los ángulos en las estructuras PTH1R activas (92 °) e inactivas (164 °) (Fig. 2e, centro y derecha, y datos extendidos Fig. 5c, abajo). Estos resultados indican que PCO371 se une directamente al bolsillo del transductor intracelular y actúa como una cuña molecular (Datos extendidos Fig. 5d). Esta posición de unión estabiliza el importante movimiento hacia el exterior de la porción intracelular de TM6 sin propagación de señal desde el lado extracelular, que es distinto de cualquiera de los agonistas de clase B1 y pares de GPCR analizados previamente.

Para obtener información sobre el mecanismo de activación de PTH1R inducida por PCO371, comparamos tres motivos clave entre los GPCR de clase B1: el motivo activo PYQ (Pro6.47–Tyr6.53–Gln7.49); el conmutador PxxG (Pro6.47–x–x–Gly6.50); y el HETY (His2.50–Glu3.50–Thr6.42–Tyr7.59) motivo inactivo17,26. PTH unida al bolsillo ortostérico y reordenamiento inducido alostéricamente para reconstruir la red de enlaces de hidrógeno del motivo activo PYQ (Datos extendidos Fig. 6a, b, izquierda). Estos cambios conformacionales facilitaron la torcedura aguda en TM6 en Gly4186.50 en el motivo PxxG, reubicando Leu4166.48 y Phe4176.49 (Datos extendidos Figs. 6c, d). El movimiento de Leu4166.48 y Phe4176.49 creó un grupo hidrofóbico y estabilizó la conformación externa de la mitad intracelular de TM6 (Datos extendidos Fig. 6d). En consecuencia, el Leu4166.48 reubicado empujó a Tyr4597.59, colapsando el motivo inactivo HETY y abriendo la cavidad intracelular para el alojamiento de la proteína G (Datos extendidos Fig. 6e).

El TMD de PTH1R unido a PCO371 deformó el motivo activo PYQ y el interruptor PxxG de TM6 en la estructura helicoidal, de manera similar a la estructura de PTH1R unido a ePTH (Figs. 2e y 3a-c y Datos extendidos Fig. 6f, g ). En contraste con las conformaciones inactivas de los motivos activos PYQ y PxxG, los grupos trifluorometoxifenilo y espiro-imidazolona de PCO371 (Fig. 1d) chocaron severamente con Val4126.44–Phe4176.49 y el motivo inactivo HETY en la estructura PTH1R unida a ePTH. , respectivamente (Datos extendidos Fig. 6h,i). Para evitar este problema estérico, nuestra estructura mostró que TM6 en PTH1R unido a PCO371 se desenrolló en Pro4156.47, lo que indicó que este residuo es necesario para la activación de PTH1R específica de PCO371. De acuerdo con estas observaciones estructurales, una mutación en el motivo PYQ (Q4517.49A) y en el interruptor PxxG (L4166.48A, F4176.49A y G4186.50L) ​​redujo selectivamente la acumulación de cAMP inducida por PTH pero no afectó la actividad de PCO371. Fig. 3d y Datos ampliados Fig. 7). Por el contrario, la mutación P4156.47L eliminó selectiva y completamente la actividad de PCO371 pero no mostró un efecto significativo sobre la actividad de PTH (Fig. 3d y Datos ampliados Fig. 7). Estos resultados indican que Pro4156.47 es esencial para la activación de PTH1R mediada por PCO371 sin el reordenamiento conformacional del motivo PYQ y el interruptor PxxG.

a, región TMD de PTH1R unido a PCO371. b, c, Vista ampliada del motivo activo PYQ y el interruptor activo PxxG. d, respuestas de cAMP de GloSensor en PTH1R de tipo salvaje (WT) y el motivo PYQ o los mutantes de cambio PxxG después de la estimulación con PTH o PCO371. Los valores de la concentración efectiva semimáxima logarítmica negativa (pEC50) y la respuesta máxima (Emax) se calcularon a partir de las curvas de concentración-respuesta (Datos extendidos Fig. 7a,c). *P < 0,05 y **P < 0,01, calculados mediante análisis de varianza (ANOVA) de dos vías seguido de la prueba de Dunnett para análisis de comparación múltiple (con referencia al WT). NS, no significativamente diferente entre los grupos. e, Superposición de complejos PCO371–PTH1R–Gs, isoproterenol–β1 adrenalina receptor (β1AR)–Gs y formoterol–β1AR–β-arrestin, alineados en TM2–TM5. Las flechas negras indican los cambios conformacionales característicos de TM5 y TM6 en las estructuras unidas a Gs y β-arrestina (izquierda). PCO371 choca con TM6 en el círculo discontinuo (centro y derecha). f, Curvas de concentración-respuesta del reclutamiento de β-arrestina 1 y β-arrestina 2 a PTH1R después de la estimulación con PTH o PCO371. g, Colocalización de PTH1R–β-arrestina 2 en respuesta a PCO371 y diferentes concentraciones de PTH. Cuantificación de la colocalización de PTH1R y β-arrestina 2 después de la estimulación con vehículo, PTH 100 nM, PTH 10 pM o PCO371 100 µM. El índice de colocalización para células individuales en cada condición de estimulación se calculó utilizando Fiji (ImageJ). Los símbolos y las barras de error representan las medias y sem, respectivamente, de 10 a 19 celdas. *P < 0,05 y **P < 0,01, calculados usando ANOVA unidireccional seguido de la prueba de Dunnett para análisis de comparación múltiple con referencia a la estimulación del vehículo. Los datos son de tres experimentos independientes (d, f).

Datos fuente

En general, la conformación TM6 es crucial para la unión preferencial de transductores específicos y la señalización sesgada. Estudios previos han demostrado que la unión preferencial de las proteínas G requiere un importante movimiento hacia afuera de TM6 y una gran cavidad intracelular, mientras que para las β-arrestinas requiere un ligero movimiento hacia afuera de TM6 y una pequeña cavidad intracelular27,28,29. PCO371 actúa como una cuña molecular que estabilizó la conformación significativamente hacia afuera de TM6 intracelular (Fig. 3e y Datos extendidos Figs. 5d y 8a, b), lo que indicó que PCO371 activa preferentemente las proteínas G en lugar de las β-arrestinas. De acuerdo con nuestros hallazgos estructurales, los ensayos basados ​​en NanoBiT revelaron que la unión de PCO371 provocó señales de reclutamiento insignificantes para β-arrestina 1 y β-arrestina 2 (Fig. 3f). Posteriormente, para demostrar completamente que PCO371 es un agonista sesgado por la proteína G, observamos la translocación intracelular de PTH1R-β-arrestina mediante microscopía confocal. Expresamos PTH1R fusionado con Flag-tag y β-arrestin 2 fusionado con mVenus en células HEK293. El receptor se marcó con un anticuerpo Flag-M1 fusionado con Alexa-647, y su localización en la membrana y subcelular se visualizó mediante microscopía confocal. La colocalización intracelular de PTH1R y β-arrestina 2 ocurrió 30 minutos después de la estimulación con una concentración alta (100 nM) y una concentración baja (10 pM) de PTH (Fig. 3g y Datos extendidos Fig. 8c). Por el contrario, esta colocalización intracelular no se observó después de la estimulación con una concentración alta (100 µM) de PCO371, que es equivalente a la estimulación de PTH 10 pM en el ensayo cAMP (Fig. 3g y Datos extendidos Fig. 8c). Tomados en conjunto, concluimos que PCO371 es un agonista sesgado de proteína G. Nuestro estudio proporciona evidencia estructural de que el agonista intracelular PCO371 activa selectivamente las proteínas G y que se puede inducir un mecanismo de señalización directamente sesgado sin transducción de señal alostérica.

Nuestra estructura mostró que PCO371 interactúa con el bolsillo intracelular formado por los residuos altamente conservados de los GPCR de clase B1 (Arg2192.46, His2232.50, Leu2262.53, Ile2993.47, Glu3023.50, Leu3063.54, Val4126.44, Leu4136 .45, Met4146.46, Pro4156.47, Leu4166.48, Phe4176.49, Gly4186.50, Phe4547.52, Tyr4597.57 y Asn4638.47) (Fig. 4a,b). Para evaluar las aplicaciones potenciales relacionadas con este bolsillo, medimos los niveles de producción de AMPc inducida por PCO371 en todos los GPCR de clase B1 mediante un ensayo de acumulación de AMPc. Sorprendentemente, PCO371 activó 7 de 15 GPCR de clase B1 (Fig. 4c y datos extendidos, Fig. 8d). Comparamos la similitud de secuencias de GPCR mediante un análisis de árbol filogenético30 (calculado usando GPCRdb (https://gpcrdb.org/) y descubrimos que PCO371 activa los receptores asignados al mismo grupo, el clado PTH1R, con la excepción de PTH2R y el receptor de glucagón ( GCGR) (Fig. 4d).

a, región TMD de PTH1R unido a PCO371 (superior) y vista ampliada de la región de unión a PCO371 (centro e inferior). b, Alineación de la secuencia de aminoácidos de los GPCR de clase B1 humanos. Los residuos descritos interactúan con PCO371. c, respuestas de cAMP GloSensor inducidas por PCO371 entre GPCR de clase B1. Los valores en el gráfico de radar indican los valores logarítmicos de la actividad intrínseca relativa (∆log RIAPCO-péptido), que se define como el valor Emax/EC50 (RIAPCO) en cada receptor normalizado por el valor Emax/EC50 luego de la estimulación por sus agonistas peptídicos endógenos (péptido RIA). Las líneas y las regiones sombreadas representan las medias y sem, respectivamente, de tres experimentos independientes, cada uno realizado por duplicado. Tenga en cuenta que en ocho GPCR insensibles a PCO371 (PTH2R, GIPR, GLP-2R, GLP-1R, CRF1R, CRF2R, CALCR y CALRL), no se pudieron calcular los valores de RIAPCO. Por lo tanto, los valores de ∆log RIAPCO-péptido se indican como inferiores a -7. d, Árbol filogenético de los GPCR de clase B1. Los receptores sensibles a PCO371 e insensibles a PCO371 se indican con líneas rojas y azules, respectivamente. PCO371 activa miembros del clado PTH1R, excepto PTH2R y GCGR. e, Curvas de concentración-respuesta de las respuestas de cAMP de GloSensor de WT y L3706.47P mutante (L370P) PTH2R después de la estimulación con PTH o PCO371. Los símbolos y las barras de error representan las medias y sem, respectivamente, de tres experimentos independientes realizados por duplicado.

Para determinar por qué PCO371 no pudo activar PTH2R, investigamos el residuo de leucina no conservado en la posición 6.47. Dado que los GPCR de clase B1 adoptan ampliamente el residuo de prolina en la posición 6.47, que tiene un papel crucial en el reconocimiento de PTH1R por PCO371 (Fig. 3d y datos extendidos, Fig. 6f), examinamos si la falta de respuesta a PCO371 es causada por los diferentes aminoácido en la posición 6.47 en PTH2R. De acuerdo con nuestra hipótesis, el mutante L3706.47P PTH2R generó una acumulación de cAMP en respuesta a PCO371 (Fig. 4e y Extended Data Fig. 8e). Teniendo en cuenta que la PTH activó tanto el PTH1R de tipo salvaje como el P4156.47L, mientras que PCO371 no activó el PTH1R P4156.47L (Fig. 3d), concluimos que Pro6.47 es un determinante esencial para la activación del receptor inducido por PCO371.

Nuestro trabajo reveló que PCO371 es un agonista versátil para siete GPCR de clase B1 (Fig. 4c, d), lo que sugiere que este candidato a fármaco de fase 1 disponible por vía oral puede ser una semilla de fármaco prometedora para apuntar a estos receptores. Sin embargo, quedan preguntas con respecto a la selectividad del receptor de PCO371 entre el clado PAC1R y los clados GLP-1R (Fig. 4d). Sobre la base de comparaciones estructurales con el GLP-1R unido al compuesto 2, especulamos que el movimiento concomitante de las mitades extracelular e intracelular de TM6 es una característica clave para la activación específica. El compuesto 2 es un agonista intracelular que se une al exterior de la TM6 intracelular (datos ampliados, Fig. 9a,b, izquierda). La estructura de GLP-1R unida al compuesto 2 exhibió la típica torcedura aguda en TM6, similar a las estructuras activas unidas a péptidos ortostéricos11 (Fig. 2e y Datos extendidos Fig. 9b,c). La conformación extracelular de GLP-1R presumiblemente se reorganiza junto con el cambio conformacional en el lado intracelular. Aunque este cambio conformacional de adentro hacia afuera en GLP-1R es una característica común observada en otros GPCR, como los GPCR de clase A, no se observó un cambio conformacional extracelular en PTH1R unido a PCO371. Por lo tanto, propusimos que PCO371 solo activa un grupo de GPCR que no requieren el cambio de TM6 de adentro hacia afuera para la activación del receptor porque PCO371 no puede unirse a los receptores que adoptan la conformación extracelular típicamente activada (Fig. 2d). Para probar esta hipótesis, diseñamos tres receptores quiméricos: PTH1R (TM6 reemplazado por GLP-1R), PTH1R (TM6 reemplazado por PAC1R) y GCGR (TM6 reemplazado por GLP-1R) y medimos la producción de cAMP inducida. por PCO371. En particular, estos receptores mostraron solo diferencias menores en sus respuestas de ligando endógeno, lo que sugirió que estos receptores quiméricos retienen sus actividades de receptor (Datos extendidos Fig. 9d). Además, PTH1R (TM6-GLP-1R) eliminó por completo la producción de AMPc por PCO371, mientras que PTH1R (TM6-PAC1R) mostró una producción de AMPc distinguible por PCO371 (Datos extendidos Fig. 9d). De acuerdo con nuestra noción, GCGR (TM6-GLP-1R) también carecía principalmente de producción de cAMP por PCO371 (Datos extendidos Fig. 9d). Estos resultados respaldan firmemente nuestra propuesta de que PCO371 activa receptores que pueden movilizar de forma independiente la mitad intracelular de TM6 de la mitad extracelular.

En este estudio, identificamos un nuevo bolsillo agonista intracelular de PTH1R y un proceso de activación atípico en el que PCO371 actúa como una cuña molecular. Las estructuras de GPCR de clase B1 informadas anteriormente han revelado los mecanismos comunes de transducción de señales alostéricas por péptidos y pequeños agonistas químicos que se unen al sitio ortostérico, aunque los modos de unión difieren entre los agonistas químicos y los agonistas de péptidos (datos extendidos, figuras 4 y 5). En contraste con estos ligandos informados anteriormente, PCO371 se une directamente al bolsillo del transductor intracelular de PTH1R y lo activa sin requerir la transducción de señales alostéricas desde el lado extracelular (Fig. 5). Estos resultados sugieren que PCO371 atraviesa con éxito la membrana celular y accede directamente al lado intracelular o región intramembrana como un lípido de membrana (Fig. 5). En lugar de inducir la típica torcedura aguda en TM6 en Gly4186.50, PCO371 desenrolla TM6 en Pro4156.47, que es necesario para su actividad (Figs. 3e y 5 y Datos extendidos Fig. 6b,f). Nuestro estudio reveló un mecanismo distinto para la activación de GPCR, que amplía el potencial de las estrategias de desarrollo de fármacos.

La activación distinta y el mecanismo de selectividad funcional de PTH1R. Arriba, la PTH induce la reorganización de las porciones extracelulares de TM1, TM6 y TM7, lo que provoca el movimiento hacia el exterior de la porción intracelular de TM6 y la formación de un pliegue en Gly4186.50. El PTH1R unido a PTH puede adoptar conformaciones preferenciales para proteínas G y arrestinas β, respectivamente. En la parte inferior, PCO371 mueve directamente la porción intracelular de TM6 hacia el exterior y provoca la formación de una torcedura moderada en TM6 en Pro4156.47 sin requerir un reordenamiento extracelular. El PTH1R unido a PCO371 únicamente adopta la conformación preferencial para las proteínas G al estabilizar la conformación externa de la porción intracelular de TM6. ECD, dominio extracelular.

Los bolsillos de ligandos intracelulares han recibido un interés considerable en la farmacología de GPCR debido a su potencial para interactuar selectivamente y activar transductores de señales específicos. Hasta ahora, se han informado las estructuras de múltiples antagonistas, moduladores alostéricos positivos y un modulador ago-alostérico en complejo con sus GPCR correspondientes1,4,5,6,11,12 (Fig. 9a ampliada). Aunque estos ligandos se unen a la región intracelular de cada GPCR, no existe una estructura que acomode un agonista en el bolsillo del transductor intracelular, lo que limita los conocimientos estructurales relacionados con la señalización sesgada desde el lado intracelular. Nuestra estructura proporciona una vista detallada de un agonista unido a la cavidad intracelular e interactuando directamente con una proteína G. Dado que las proteínas G requieren una conformación de cavidad abierta, mientras que las β-arrestinas prefieren una conformación cerrada27,28,29, se considera que el tamaño de esta cavidad es fundamental para el agonismo sesgado (Fig. 3g-i y Datos extendidos Fig. 8a,b ). El agonismo sesgado por la proteína G es beneficioso para el descubrimiento de fármacos con los GPCR de clase B1 porque la activación de la β-arrestina mediada por GPCR de clase B1 generalmente induce una señalización prolongada a través del endosoma temprano, lo que conduce a efectos adversos31. PCO371 interactúa directamente con el gancho C-terminal de Gαs, que presenta secuencias divergentes entre las subunidades de Gα. Por lo tanto, las modificaciones de PCO371 pueden obtener una funcionalidad selectiva adicional entre los subtipos de proteína G (datos extendidos, Fig. 9e, f).

Para analizar más a fondo la sensibilidad de PCO371 en los GPCR de clase B1, superpusimos e inspeccionamos cuidadosamente los GPCR de clase B1 endógenos unidos a ligandos informados anteriormente. Notamos una conformación alternativa de Asn5.50 entre GCGR y el receptor de polipéptido inhibidor gástrico (GIPR), que es genéticamente similar pero con diferente sensibilidad para PCO371 (Datos extendidos Fig. 10a, b). Las estructuras GPCR de clase B1 activas superpuestas mostraron que los receptores insensibles a PCO371 adoptaron la conformación Asn5.50 externa hacia TM3, mientras que los receptores sensibles a PCO371 adoptaron la conformación interna hacia el centro del receptor (Fig. 4d y Datos extendidos Fig. 10c ). También realizamos tres simulaciones de dinámica molecular independientes, a partir de nuestra estructura crio-EM PTH1R unida a PCO371, y analizamos la funcionalidad de Asn5.50 para el reconocimiento de PCO371. Estas simulaciones mostraron que el TMD del receptor mantuvo una conformación activa similar a la estructura crio-EM, y PCO371 se unió de manera estable al receptor (Datos extendidos Figs. 10d, dos paneles superiores). La conformación de Asn5.50 se mantuvo estable en su posición en nuestra estructura crio-EM de PTH1R unida a PCO371, que es distinta de la estructura activa de GLP-1R unida a GLP-1 (identificador de Protein Data Bank (PDB): 6X18) ( Datos extendidos Fig. 10d, segundo desde abajo, y 10e). En particular, en la segunda ejecución, el receptor mostró un estado intermedio y PCO371 creó una interacción nueva y estable con Asn3745.50 (Datos extendidos Fig. 10d, abajo, 10f, g). De acuerdo con la simulación, el mutante N3745.50A PTH1R redujo selectivamente la activación del receptor inducido por PCO371, mientras que este mutante no tuvo ningún efecto sobre la activación del receptor inducido por PTH (Datos extendidos Fig. 10h). Estos resultados sugieren que la orientación de la cadena lateral de Asn3745.50 es crucial para el reconocimiento de PCO371 y que Asn3745.50 puede responder a PCO371 cuando su cadena lateral está orientada hacia el centro del receptor (datos extendidos Fig. 10a-c). Combinados con nuestras simulaciones de dinámica molecular y estudio funcional, estos resultados sugieren que Asn5.50 es uno de los determinantes para el reconocimiento y la sensibilidad de PCO371 en los GPCR de clase B1. En el futuro, la estructura del GCGR unido a PCO371 puede proporcionar una comprensión integral de la selectividad del receptor de PCO371.

En el desarrollo de fármacos, la especificidad del receptor es crucial para la eficacia y seguridad terapéuticas. Para los GPCR, el núcleo de TMD comparte una gran similitud de secuencia, mientras que los bucles extracelulares e intracelulares tienen secuencias diversas. Estas diferencias indican que los agonistas obtienen selectividad del receptor al extender el ligando hacia el exterior del receptor32. Nuestra estructura reveló que la cavidad intracelular de PTH1R unido a PCO371 está herméticamente sellada por Gs, y PCO371 no puede interactuar con los bucles intracelulares (Datos extendidos Fig. 11a, b). En cambio, el bolsillo de unión al ligando de PCO371 está lateralmente abierto entre TM6 y TM7, que es accesible a la hélice 8 (datos extendidos, figura 11b, izquierda). Además, nuestra estructura visualizó un bolsillo intracelular que consiste en TM1, TM7 y hélice 8, mirando hacia la región de la membrana. Dado que la hélice 8 posee diversidad de secuencias, una molécula de unión unida a este bolsillo puede proporcionar selectividad de receptor, lo que lleva al desarrollo de un ligando biotópico (Datos extendidos Fig. 11c, d). Además, PTH1R posee un residuo de cisteína no conservado en la posición 7.60 en el bucle intracelular, que conecta TM7 y la hélice 8 (Datos ampliados Fig. 11c, derecha). Tenga en cuenta que solo PTH1R, PTH2R y CALCR tienen el residuo de cisteína en la posición 7.60 y PCO371 no activa CALCR y PTH2R. Por lo tanto, la adición de un grupo funcional covalente a PCO371 puede proporcionar selectividad del receptor de PCO371 hacia PTH1R. Cβ de Cys7.60 está ubicado a 6,4 Å del O6 de PCO371 (datos extendidos, figura 11c, derecha), y tres o cuatro residuos de carbono serían suficientes para conectar PCO371 y Cys7.60. Además, los agentes covalentes previamente informados (compuesto 2) 11 para GLP-1R también pueden ser útiles en la generación de ligandos biotópicos. El compuesto 2 actúa como un agente de enlace covalente débil y se une selectivamente a Cys3476.36. Al optimizar la unión del compuesto 2 a la cavidad formada por TM6, TM7 y Gαs de PTH1R, un compuesto 2-PCO371 modificado puede convertirse en un agonista selectivo de PTH1R.

En resumen, el bolsillo del transductor intracelular distinto identificado en este estudio puede tener un amplio potencial en el desarrollo de compuestos químicos sesgados para agonistas, antagonistas y moduladores alostéricos. Nuestros hallazgos ampliarán la comprensión general de los mecanismos de activación de GPCR y proporcionarán nuevas estrategias para el diseño y desarrollo de terapias dirigidas a GPCR.

El plásmido que codifica PTH1R humano (identificador de GenBank: U17418.1; residuos 27–491) se construyó y purificó como se informó anteriormente17. La construcción se expresó en células HEK293 GnTI (N-acetilglucosaminiltransferasa I-negativas) (American Type Culture Collection, CRL-3022) usando el sistema BacMam (Thermo Fisher Scientific), y las células se cultivaron y mantuvieron en medio FreeStyle 293 (Gibco) a 37 °C, con 8% de CO2 en condiciones de humedad. Tenga en cuenta que las células fueron infectadas por el baculovirus generado en células Sf9 (Life Technologies), suplementadas con butirato de sodio 10 mM para aumentar la expresión de proteínas después de 18 h y cultivadas en suspensión a 30 ° C durante otras 48 h. Las células cultivadas se recogieron mediante centrifugación (5000 g, 10 min, 4 °C) y se rompieron mediante sonicación en un tampón de lisis hipotónico (Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM y glicerol al 20 %). Los restos celulares se eliminaron por centrifugación (10 000 g, 10 min, 4 °C). La fracción de membrana se recogió mediante ultracentrifugación a 180 000 g durante 1 h y se solubilizó en un tampón de solubilización (Tris-HCl 20 mM, pH 9,0, NaCl 200 mM, LMNG al 1 %, CHS al 0,1 %, glicerol al 20 % y PCO371 100 μM) durante 2 h a 4 °C. Los receptores solubilizados se separaron del material insoluble por ultracentrifugación a 180.000 g durante 20 min y se incubaron con resina Ni-NTA (Qiagen) durante 30 min. Las micelas de detergente se reemplazaron lavando con 20 volúmenes de columna de tampón de lavado (Tris-HCl 20 mM, pH 9,0, NaCl 500 mM, GDN al 0,03 %, glicerol al 10 %, PCO371 100 μM e imidazol 30 mM). El receptor se eluyó en tampón de elución (Tris-HCl 20 mM, pH 9,0, NaCl 500 mM, GDN al 0,01 %, glicerol al 10 %, PCO371 100 μM e imidazol 300 mM). El eluato se trató con proteasa TEV para escindir la etiqueta GFP-His10 y se dializó frente a tampón de diálisis (Tris-HCl 20 mM, pH 9,0, NaCl 500 mM, PCO371 100 μM y glicerol al 10 %). Las etiquetas GFP-His10 escindidas y las proteasas TEV se eliminaron con resina Ni-NTA. El receptor se purificó mediante cromatografía de exclusión por tamaño en una columna Superdex 200 10/300 Increment, equilibrada en tampón SEC (20 mM Tris-HCl, pH 9,0, 150 mM NaCl, 0,01 % GDN y 100 μM PCO371). Las fracciones máximas se recogieron y concentraron hasta aproximadamente 5 mg ml–1.

El plásmido que codifica mini-G se construyó y purificó como se informó previamente34. Mini-Gs se expresó en células de Escherichia coli (BL21). Las células se cultivaron en medio LB suplementado con isopropil-β-d-tiogalactopiranósido (IPTG) 1 mM a 25 °C. Después de 20 h, las células se rompieron mediante ultrasonicación en tampón hipotónico (Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, MgCl2 2 mM y GDP 1 μM), y la proteína mini-Gs se purificó mediante cromatografía de afinidad Ni-NTA. y luego se sometió a cromatografía de exclusión por tamaño en una columna HiLoad Superdex75 16/600.

Gβ1 de rata fusionada con etiqueta His6 y Gγ2 bovina también se construyeron, expresaron y purificaron como se informó anteriormente17. Los cultivos celulares se cultivaron hasta una densidad celular de 4 × 106 células por ml en medio Sf900 II (Gibco) durante 60 ha 27 °C. Las células se recogieron por centrifugación y se lisaron en tampón hipotónico. El heterodímero Gβ1-Gγ2 se purificó mediante cromatografía de afinidad Ni-NTA y luego se sometió a cromatografía de exclusión por tamaño en una columna HiLoad Superdex75 16/600.

Las mini-G y Gβ1-Gγ2 purificadas se mezclaron y se incubaron durante la noche en hielo. La mezcla se concentró y se cargó en una columna de exclusión por tamaño de aumento Superdex 75 10/300 y se equilibró en tampón (Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM y GDP 1 µM). Las fracciones pico que contenían el heterotrímero mini-Gs se agruparon y concentraron a 5 mg ml–1.

El plásmido que codifica Nb35 se preparó como se informó anteriormente17,35. La proteína se expresó en el periplasma de células E. coli C41 (Rosetta) cultivadas en medio LB suplementado con IPTG 1 mM durante 20 ha 25 °C. Después de 20 h, las células se recogieron y se rompieron por ultrasonicación en tampón hipotónico (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl y 2 mM MgCl2), y la proteína Nb35 se purificó por cromatografía de afinidad Ni-NTA y luego se sometió a cromatografía de exclusión por tamaño en una columna HiLoad Superdex75 16/600. Las fracciones máximas se agruparon y concentraron a 3 mg ml–1.

PCO371 se sintetizó en Chugai Pharmaceutical y su pureza y estabilidad se confirmaron mediante cromatografía líquida-espectrometría de masas. Las proteínas PTH1R unidas a PCO371 purificadas se mezclaron con un exceso molar de 1,2 veces de mini-Gsβ1γ2 y un exceso molar de 1,5 veces de Nb35, y la mezcla se incubó en hielo durante la noche a pH 9,0. La muestra se purificó con resina de afinidad Ni-NTA y se cargó en una columna de exclusión por tamaño de aumento Superdex 200 10/300, equilibrada en tampón (Tris-HCl 20 mM, pH 9,0, NaCl 150 mM, GDN al 0,01 % y PCO371 100 μM) para separar el complejo de los contaminantes. Las fracciones máximas del complejo PCO371-PTH1R-mini-Gs heterotrimer-Nb35 se combinaron y concentraron a 7 mg ml-1.

El complejo purificado se aplicó sobre una rejilla de carbón perforado Quantifoil recién descargada luminiscente (R1.2/1.3, Au, malla 300) utilizando un Vitrobot Mark IV a 4 °C con una humedad del 100 %. Las rejillas preparadas se transfirieron a un microscopio Titan Krios G4 (Thermo Fisher Scientific), operado a un voltaje de aceleración de 300 kV con un filtro de energía Gatan Quantum-LS (GIF) y un detector de electrones directo Gatan K3 Summit en modo nanoprobe EFTEM. Las imágenes se recopilaron con un aumento nominal de 105 K, correspondiente a un tamaño de píxel calibrado de 0,83 Å por píxel (Universidad de Tokio, Japón). El conjunto de datos se adquirió con el software Serial EM (v.3.7.4), con un rango de desenfoque de −0,8 a −1,6 μm. Cada imagen se fraccionó en dosis a 72 fotogramas a una tasa de dosis de 7,5 e-píxel-1 s-1 para acumular una dosis total de 54,578 e-Å-2. Las 6.333 películas fraccionadas por dosis se sometieron a corrección de movimiento inducida por haz utilizando RELION-3 (ref. 36), y la función de transferencia de contraste y los parámetros de desenfoque se estimaron utilizando CTFFIND4 (ref. 37). Las 4.880.293 partículas se seleccionaron inicialmente de las 6.333 micrografías utilizando la función de selección de Laplaciano de Gauss en RELION-3 y se extrajeron en 3,63 Å por píxel. Estas partículas se sometieron a varias rondas de clasificaciones en 2D y 3D. La mejor clase contenía 109 422 partículas, que luego se volvieron a extraer con un tamaño de píxel de 1,11 Å por píxel y se sometieron a refinamiento 3D. El subconjunto homogéneo se sometió a refinamiento de desenfoque por partícula, refinamiento de inclinación de haz, pulido bayesiano y refinamiento 3D. El refinamiento 3D final y el posprocesamiento produjeron mapas con una resolución global de 2,9 Å según el criterio de correlación de capa de Fourier = 0,143. La estrategia de procesamiento se describe en Datos extendidos Fig. 2.

La plantilla inicial para el complejo PTH1R–Gs–Nb35 se derivó de la estructura PTH–PTH1R–Gs–Nb35 (identificador PDB: 7VVL), seguida de una extensa remodelación usando COOT-0.9.3 EL38. Los modelos de PCO371–PTH1R–Gs se reajustaron manualmente usando COOT, se refinaron usando phenix.real_space_refine (v.1.14-3260)39 REFMAC540 y Servalcat41 contra los mapas de trabajo y se validaron en MolProbity42.

El sistema incluía PTH1R, PCO371, 1-fosforil-2-oleoilfosfatidilcolina (POPC), agua TIP3P y NaCl 150 mM. El modelo inicial de PTH1R que contenía los aminoácidos 27–491 se creó utilizando MODELLER (v.10.1)43, con la estructura crio-EM de PTH1R en complejo con PCO371 como plantilla. Los átomos de hidrógeno que faltan se construyeron con el programa VMD (v.1.9.3)44. La proteína se incrustó en la membrana de POPC usando la tubería MemProtMD45. La carga neta del sistema de simulación se neutralizó mediante la adición de NaCl 150 mM. El sistema de simulación fue de 96 × 96 × 180 Å3 y contenía 123 567 átomos. Las topologías moleculares y los parámetros del campo de fuerza Charmm3646 se utilizaron para las moléculas de proteína, lípido y agua. La topología molecular y los parámetros para PCO371 se prepararon utilizando el lector y modelador de ligandos CHARMM-GUI47,48.

Las simulaciones de dinámica molecular se realizaron con el programa NAMD (v.2.13). Se minimizó la energía de los sistemas de simulación en 1000 pasos con posiciones fijas de los átomos que no son de hidrógeno. Después de la minimización, se realizaron otros 1000 pasos de minimización de energía con restricciones de 10 kcal mol-1 para los átomos que no son de hidrógeno, excepto para las moléculas de lípido dentro de 5,0 Å de las proteínas. A continuación, se realizaron equilibrios durante 0,1 ns en condiciones de NVT, con restricciones de 10 kcal mol-1 Å-2 para los átomos pesados ​​de las proteínas. Finalmente, el equilibrio se realizó durante 2,0 ns en condiciones NPT, con restricciones de 1,0 kcal mol-1 Å-2 para todos los átomos de Cα de las proteínas. Las corridas de producción se realizaron durante 200 ns sin restricciones manteniendo una temperatura constante a 310 K usando dinámica de Langevin y una presión constante a 1 atm usando un pistón Nosé-Hoover Langevin49,50. Las interacciones electrostáticas de largo alcance se calcularon utilizando el método de malla de partículas de Ewald50. Las simulaciones se realizaron de forma independiente tres veces. Los resultados de la simulación se analizaron y visualizaron utilizando mdtraj (v.1.9.8)51, seaborn (https://zenodo.org/record/54844) y CUEMOL (v.2.2.3.443) (http://www.cuemol. org).

La activación de Gs inducida por PTH1R se midió utilizando el ensayo de acumulación de AMPc GloSensor. En primer lugar, construimos un plásmido en el que el gen PTH1R humano de longitud completa se fusionó en el extremo N con la etiqueta del epítopo Flag con la secuencia señal derivada de la hemaglutinina anterior. Las células HEK293A se sembraron en una placa de cultivo de 6 cm a una concentración de 2 × 105 células por ml (4 ml por pocillo en DMEM (Nissui Pharmaceutical) suplementado con FBS al 10% (Sigma, F7524, lote 0001641439) y penicilina-estreptomicina- glutamina (DMEM completo)) 1 día antes de la transfección. La solución de transfección se preparó combinando 10 μl (por pocillo de aquí en adelante) de 1 mg ml–1 de solución de polietilenimina MAX (Polysciences) y una mezcla de plásmidos que constaba de 1000 ng de biosensor de AMPc Glo-22F (codón humano optimizado y sintetizado por genes)- codificando plásmidos pCAGGS y 400 ng de plásmidos Flag-PTH1R en 400 µl de Opti-MEM (ThermoFisher Scientific). Después de la incubación durante 24 h, las células transfectadas se recogieron utilizando PBS de Dulbecco (D-PBS) que contenía EDTA 0,53 mM, se centrifugaron y se suspendieron en 2 ml de HBSS que contenían BSA al 0,01 % (grado libre de ácidos grasos; SERVA) y HEPES 5 mM. (pH 7,4) (tampón de ensayo). La suspensión celular se dispensó en una placa blanca de 96 pocillos a un volumen de 40 μl por pocillo y se cargó con 10 μl de solución de d-luciferina potásica 10 mM (FujiFilm Wako Pure Chemical) diluida en tampón de ensayo. Después de 2 h de incubación a temperatura ambiente, se midió la luminiscencia de referencia de la placa (SpectraMax L equipado con 2PMT, Molecular Devices; SoftMax Pro (v.7.03), Molecular Devices) y 20 μl de ligando 6x diluido en el tampón de ensayo o el tampón de ensayo solo (vehículo) se añadió manualmente. La placa se leyó durante 20 min con un intervalo de 30 s a temperatura ambiente. Los recuentos de luminiscencia durante 8 a 10 minutos después de la adición del ligando se promediaron y normalizaron con respecto a los recuentos iniciales, y los cambios en las señales durante el tratamiento con vehículo se normalizaron aún más a forskolina (10 µM) y se trazaron para la respuesta de acumulación de AMPc. Usando el software Prism 9 (GraphPad), la respuesta se ajustó a todos los datos usando la regresión no lineal. Se utilizó la pendiente variable (cuatro parámetros) en la herramienta Prism 9 con una restricción de la pendiente Hill de valor absoluto menor a 2. Los valores pEC50 y Emax se obtuvieron a partir de la curva de regresión no lineal de los datos promediados. Para el análisis de comparación múltiple, se utilizó ANOVA de una o dos vías seguido de la prueba de Dunnett.

El reclutamiento de β-arrestina a PTH1R se midió utilizando el ensayo de reclutamiento de β-arrestina NanoBiT52 con modificaciones menores. En resumen, la transfección del plásmido se realizó en una placa de cultivo de 6 cm con una mezcla de 200 ng de β-arrestina 1 fusionada con BiT grande N-terminal (Lg-β-arrestina 1) o Lg-β-arrestina 2 y 1000 ng de C pequeños plásmidos PTH1R (PTH1R-Sm) fusionados con BiT terminales. Después de 24 h de incubación, las células transfectadas se recogieron utilizando D-PBS que contenía EDTA 0,53 mM, se centrifugaron a 190 g durante 5 min y se suspendieron en 4 ml del tampón de ensayo descrito para el ensayo GloSensor. La suspensión celular se dispensó en una placa blanca de 96 pocillos a un volumen de 80 μl por pocillo (en adelante, placa de 96 pocillos) y se cargó con 20 μl de coelenterazina 50 μM (Carbosynth) diluida en el tampón de ensayo. Después de 2 h de incubación a temperatura ambiente, se midió la luminiscencia de referencia de la placa (SpectraMax L equipado con 2PMT, Molecular Devices; SoftMax Pro (v.7.03), Molecular Devices) y 20 μl de ligando 6x diluido en el tampón de ensayo o El vehículo se agregó manualmente. La placa se leyó durante 15 min con un intervalo de 40 s a temperatura ambiente. Los recuentos de luminiscencia de 13 a 15 min después de la adición del ligando se promediaron y normalizaron a los recuentos iniciales. la respuesta se ajustó a todos los datos utilizando el mismo procedimiento que se describe para el ensayo GloSensor.

La expresión de PTH1R en la superficie celular se midió utilizando un método de citometría de flujo descrito previamente17. En resumen, las células HEK293A se sembraron en una placa de cultivo de 6 pocillos a una concentración de 2 × 105 células por ml 1 día antes de la transfección. La transfección se realizó usando el mismo procedimiento que se describe para el ensayo GloSensor. Un día después de la transfección, las células se recogieron añadiendo 100 μl de D-PBS que contenía EDTA 0,53 mM, luego 100 μl de HEPES 5 mM (pH 7,4) que contenía HBSS. La suspensión de células se transfirió a una placa con fondo en V de 96 pocillos y se marcó con fluorescencia con un anticuerpo monoclonal etiquetado con epítopo anti-Flag (DYKDDDDK) (Clon 1E6, FujiFilm Wako Pure Chemicals; 10 μg ml–1 diluidos en suero de cabra al 2 % y D-PBS (tampón de bloqueo) que contiene EDTA 2 mM y un anticuerpo secundario IgG de cabra anti-ratón (H+L) conjugado con Alexa Fluor 488 (1:200) (ThermoFisher Scientific, 10 μg ml–1 diluido en el tampón de bloqueo ). Después de lavar con D-PBS, las células se resuspendieron en 100 μl de D-PBS que contenía EDTA 2 mM y se filtraron a través de un filtro de 40 μm. La intensidad de fluorescencia de las células individuales se cuantificó utilizando un citómetro de flujo (EC800 equipado con un láser de 488 nm, Sony). La señal fluorescente derivada de Alexa Fluor 488 se registró en un canal FL1, y los datos de citometría de flujo se analizaron utilizando el software FlowJo 10 (FlowJo). Las células vivas se seleccionaron con una dispersión frontal (FS- Peak-Lin) en el ajuste de 390, con un valor de ganancia de 1, 7. Para el análisis se utilizaron valores de intensidad de fluorescencia media de aproximadamente 20.000 células por muestra.

La transfección se realizó utilizando una mezcla de 500 ng de mVenus-β-arrestin 2 y 200 ng de plásmidos Flag-PTH1R (por pocillo en una placa de 6 cm). Después de la incubación durante 1 día, las células transfectadas se recogieron y se volvieron a sembrar en una placa con fondo de vidrio recubierta de colágeno de 35 mm (Matsunami). Después de 1 día, el medio se cambió a DMEM sin rojo fenol y FBS (tampón de inanición). Después de 1 h de incubación, las células se incubaron con el anticuerpo Flag-M1 marcado con Alexa-647 (1: 2, 000) durante 1 h, se lavaron una vez en el tampón de inanición y se colocaron en el microscopio confocal. Las imágenes de células vivas se realizaron con LSM880 con Airyscan (Zeiss) equipado con una lente de inmersión en aceite ×100/1,46 alpha-Plan-Apochromat e ImmersolTM 518F/37 °C (444970-9010-000, Zeiss). Durante la obtención de imágenes de células vivas, la placa se montó en una cámara (STXG-WSKMX-SET, TOKAI HIT) para mantener las condiciones de incubación a 37 °C y 5 % de CO2. Tomamos imágenes de lapso de tiempo de dos colores con las siguientes configuraciones: intervalo de tiempo de 5 min; tiempo total de 35 min. La solución de ligando de 200 µl en BSA-HBSS al 0,01 % se añadió entre los puntos de tiempo 1 y 2. Las imágenes en serie adquiridas se procesaron con Airyscan utilizando Zeiss ZEN 2.3 SP1 FP3 (negro, 64 bits) (v.14.0.21.201). El análisis de colocalización se realizó con Fiji (v.2.0.0-rc-69/1.52p).

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Las coordenadas atómicas para el complejo PTH1R–mini-Gsβ1γ2–Nb35 unido a PCO371 se han depositado en el PDB con el código de acceso 8GW8. Los datos de microscopía electrónica asociados se han depositado en el banco de datos de microscopía electrónica con el código de acceso EMD-34305. Todos los demás datos se proporcionan con este documento. Los datos de origen se proporcionan con este documento.

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Agradecemos a R. Danev y M. Kikkawa por configurar la infraestructura crio-EM; K. Ogomori por la asistencia técnica; K. Sato, S. Nakano y A. Inoue en la Universidad de Tohoku por su asistencia en la preparación de plásmidos y los ensayos de GPCR basados ​​en células; y K. Yamashita para la validación del modelo. Este trabajo fue apoyado por las subvenciones JSPS KAKENHI JP20J21820 (K. Kobayashi), JP21H05037 (ON), JP21H04791 (AI), JP21H05113 (AI), JP18H05425 (TM), JPJSBP120213501 (AI) y JPJSBP120218801 (AI); JP19gm5910013, JP20gm0010004, JP20am0101095, JP22ama121038 y JP22zf0127007 (AI) de la Agencia de Investigación y Desarrollo Médico de Japón (AMED); JP22am0101115, JP22ama121002 (número de soporte 3272), JP22ama121012 (número de soporte 4826) y JP233fa627001 (ON); JPMJFR215T y JPMJMS2023 (AI) de la Agencia de Ciencia y Tecnología de Japón (JST); programa JST CREST 20344981 (ON); Fundación para la Ciencia Takeda (AI); la Fundación Memorial Uehara (AI); Fundación de Investigación Bioquímica de Tokio (AI); y la Fundación Daiichi Sankyo de Ciencias de la Vida (AI); y una beca de investigación de Chugai Pharmaceutical (AI, TM y ON). Los gráficos y análisis moleculares se realizaron con UCSF ChimeraX 1.0, desarrollado por Resource for Biocomputing, Visualization, and Informatics de la Universidad de California, San Francisco, con el apoyo de los Institutos Nacionales de Salud (R01-GM129325) y la Oficina de Infraestructura Cibernética y Biología Computacional, Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas.

Atsuhiro Tomita

Dirección actual: Preferred Networks, Tokio, Japón

Estos autores contribuyeron por igual: Kazuhiro Kobayashi, Kouki Kawakami

Departamento de Ciencias Biológicas, Escuela de Graduados en Ciencias, Universidad de Tokio, Tokio, Japón

Kazuhiro Kobayashi, Tsukasa Kusakizako, Atsuhiro Tomita, Michihiro Nishimura, Kazuhiro Sawada, Hiroyuki H. Okamoto y Osamu Nureki

Escuela de Graduados en Ciencias Farmacéuticas, Universidad de Tohoku, Sendai, Japón

Kouki Kawakami, Suzune Hiratsuka, Gaku Nakamura, Riku Kuwabara y Asuka Inoue

División de Investigación, Chugai Pharmaceutical, Shizuoka, Japón

Hiroshi Noda, Hiroyasu Muramatsu y Masaru Shimizu

Laboratorio de Fisiopatología de Organelos, Departamento de Ciencias de la Vida Integrativas, Escuela de Graduados en Ciencias de la Vida, Universidad de Tohoku, Sendai, Japón

Tomohiko Taguchi

Departamento de Química, Escuela de Graduados en Ciencias, Universidad de Chiba, Chiba, Japón

Takeshi Murata

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K. Kobayashi diseñó todo el experimento. K. Kobayashi. KS y HHO construyeron y purificaron los plásmidos. K. Kobayashi purificó el heterotrímero mini-Gs, Nb35 y PTH1R unido a PCO371, y preparó las rejillas complejas y crio-EM. K. Kobayashi, K. Kawakami, SH y HN realizaron los ensayos y análisis de mutación. HM y MS realizaron análisis y dirigieron este programa en base a su experiencia biológica. K. Kobayashi y TK recopilaron datos crio-EM y K. Kobayashi procesó los datos crio-EM. K. Kobayashi construyó modelos y realizó modelado y refinamiento. AT diseñó el sistema de simulación de dinámica molecular. AT y K. Kobayashi realizaron y analizaron la simulación de dinámica molecular. K. Kobayashi preparó el manuscrito inicial y K. Kobayashi, K. Kawakami, AT, TK y MN escribieron el manuscrito con aportes de todos los autores. TK, AI, TM y ON supervisaron la investigación.

Correspondencia a Asuka Inoue, Takeshi Murata u Osamu Nureki.

ON es cofundador y director externo de Curreio Inc. HN, HM y MS son empleados de Chugai Pharmaceutical. Todos los demás autores declaran no tener intereses en competencia.

Nature agradece a Sudarshan Rajagopal y a los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Sensibilidad al pH de las respuestas de cAMP GloSensor de PTH1R tras la estimulación con PTH y PCO371. Tenga en cuenta que ajustamos el tampón de ensayo (consulte también Métodos) al pH indicado. Los símbolos y las barras de error representan la media y SEM, respectivamente, de tres experimentos independientes, cada uno realizado por duplicado.

(a) Micrografía representativa de 6333 imágenes del conjunto de datos PCO371–PTH1R–Gs, que muestra la distribución de partículas PCO371–PTH1R–Gs. (b) Promedios de clases bidimensionales representativos, que indican las características de la estructura secundaria. El diámetro de las ventanas circulares es de 18 nm. ( c ) Flujo de trabajo de procesamiento de datos para el complejo PCO371-PTH1R-Gs después de la clasificación 3D. ( d ) Curvas de correlación de capa de Fourier estándar de oro (FSC), que indican una resolución global general a 2,9 Å.

( a ) Mapas y modelos de densidad Cryo-EM para PTH1R y PCO371. (b) Validación cruzada de cada modelo refinado utilizando dos medios mapas. El sobreajuste de modelos refinados se probó con un método de validación cruzada descrito anteriormente53.

( a ) Comparación del complejo PCO371-PTH1R-Gs con complejos GPCR de clase B1 unidos a péptidos endógenos y unidos a agonistas químicos ortostéricos. Debido a que no existe una estructura de PTH1R unida a un agonista químico ortostérico, utilizamos LY3502970 (un agonista del receptor de GLP-1 patentado)–GLP-1R–G para representar las estructuras de los GPCR de clase B1 unidos a un agonista químico ortostérico. Las vistas ortogonales y los modelos muestran PTH–PTH1R–Gs (PDB: 7VVL), PCO371–PTH1R–Gs (8GW8) y LY3502970–GLP-1R–Gs (PDB: 6XOX). Verde, PTH1R unido a PTH; naranja, PTH; amarillo, dominio similar a mini-Gs Ras; tomate, Gβ1; azul marino, Gγ2; azul polvo, Nb35; violeta, PTH1R unido a PCO371; carmesí, GLP-1R unido a LY3502970; azul cielo, LY3502970. gris, PTH–PTH1R–Gs; violeta, PCO371–PTH1R–Gs; rojo, LY3502970–GLP-1R–Gs. El mapa de PTH1R unido a PCO371 no muestra una densidad similar a ligando obvia en el bolsillo ortostérico, en contraste con los mapas de PTH1R unido a PTH y GLP-1R unido a LY3502970. ( b ) Vistas de corte de estructuras de PTH1R y GLP-1R unidas a péptidos endógenos y estructuras de GLP-1R unidas a agonistas químicos. Verde, PTH1R unido a PTH; naranja, PTH; blanco, GLP-1R; amarillo-verde, GLP-1; violeta, PTH1R unido a PCO371; carmesí, PCO371; amarillo, GLP-1R unido a CHU-128; azul-violeta, CHU-128; púrpura, danuglipron (PF-06882961)-GLP-1R unido; caqui, PF-06882961; rojo, GLP-1R unido a LY3502970; azul cielo, LY3502970. Solo PCO371 se une dentro de la cavidad intracelular, mientras que otros agonistas se unen de diversas formas al bolsillo ortostérico.

(a) Cuatro GPCR de clase B1 activos (verde, PTH1R; blanco, GLP-1R; rosa, receptor de glucagón [GCGR]; púrpura, receptor 1 del factor liberador de corticotropina [CRF1R]) se superponen a estructuras inactivas o similares a inactivas. (b) PTH1R unido a PTH y PTH1R unido a PCO371 se superponen a la estructura de PTH1R similar a inactiva unida a ePTH (verde, PTH1R unido a PTH; naranja, PTH; violeta, PTH1R unido a PCO371; magenta, PCO371; gris, ePTH unido a PTH1R). El PTH1R unido a PCO371 exhibió la torcedura moderada en TM6 (aproximadamente 145°), mientras que el PTH1R unido a PTH exhibió la torcedura aguda típica en TM6 (aproximadamente 90°). (c) Ángulo TM6 que consta de los tres átomos de Cα de los residuos I/M/V6.39, G6.50 y A/V/L6.54. (d) PCO371 estabiliza directamente la mitad intracelular de TM6 en la conformación externa, lo que aumenta el volumen en la cavidad interna y activa la proteína Gs.

( a ) Región TMD del PTH1R unido a PCO371. El ojo y el cuadrado indican vistas en (c-h). (b) Redes polares centrales de PTH1R activo unido a PTH unido (izquierda, violeta), PCO371-PTH1R (centro, verde) y PTH1R inactivo unido a ePTH (derecha, gris). (c-h) Las estructuras superpuestas de PTH1R unido a PTH (verde), PCO371-PTH1R (violeta) y PTH1R unido a ePTH (gris) se muestran paralelas a la membrana. Vistas ampliadas del motivo activo PYQ y el interruptor activo PxxG (c-d y f-g). Vistas ampliadas del motivo inactivo HETY (e y h). (i) Estructuras superpuestas de PCO371 (carmesí) y PTH1R unido a ePTH.

Relacionado con la figura 3d. ( a - c ) Activación de Gs inducida por PTH1R medida por el ensayo de acumulación de cAMP GloSensor y expresión en la superficie celular de WT y PTH1R mutante evaluada por el análisis de citometría de flujo. ( a ) Curvas de concentración-respuesta de la respuesta de cAMP de GloSensor en células WT PTH1R o transfectadas de forma simulada tras la estimulación con PTH o PCO371. Los símbolos y las barras de error representan la media y SEM, respectivamente, de tres experimentos independientes, cada uno realizado por duplicado. (b) Expresión en la superficie celular. Los símbolos y las barras de error representan la media y el SEM, respectivamente, y los puntos muestran datos individuales de cuatro experimentos independientes, cada uno realizado por duplicado. El análisis estadístico se realizó mediante ANOVA unidireccional seguido de la prueba de Dunnett para análisis de comparación múltiple (con referencia al WT). ns, no significativamente diferente entre los grupos. ( c ) Curvas de concentración-respuesta de la respuesta de cAMP de GloSensor de WT (líneas discontinuas) y el mutante (líneas continuas) PTH1R tras la estimulación con PTH (azul) o PCO371 (rojo). Los símbolos y las barras de error representan la media y SEM, respectivamente, de tres experimentos independientes, cada uno realizado por duplicado.

(a) Las estructuras TMD de PTH1R unido a PCO371 (violeta) y PCO371 (carmesí) se muestran paralelas a la membrana. ( b ) Estructuras superpuestas de PCO371–PTH1R–Gs y complejos de formoterol–β1AR–β-arrestina, alineados en TM 2-5. PCO371 facilita la conformación externa de la porción intracelular de TM6 y choca con la β-arrestina. ( c ) Imágenes representativas de la localización celular de PTH1R marcado con Alexa-647 (magenta) y β-arrestina 2 fusionada con mVenus (verde), relacionadas con la Fig. 3g. Estas imágenes obtenidas de 10-19 imágenes de estos experimentos. ( d ) Curvas de concentración-respuesta de la respuesta de cAMP de GloSensor de 15 GPCR de clase B1 tras la estimulación con agonista de péptido endógeno (azul) o PCO371 (rojo). Se usaron los siguientes agonistas peptídicos endógenos para cada GPCR; PTH (1–34), PTH2R: hormona liberadora de hormona del crecimiento, GHRHR; secretina, SCTR; polipéptido activador de la adenilato ciclasa pituitaria (PACAP, 1–27), VIP1R y VIP2R; PACAP (1–38), PAC1R; glucagón, GCGR; polipéptido inhibidor gástrico, GIPR; Péptido 2 similar al glucagón, GLP-2R; péptido similar al glucagón 1, GLP-1R; factor liberador de corticotropina, CRF1R y CRF2R; calcitonina, CALCR; Péptido relacionado con el gen de la calcitonina, CALRL. Todos los péptidos son secuencias derivadas de humanos. Los símbolos y las barras de error representan la media y SEM, respectivamente, de tres experimentos independientes, cada uno realizado por duplicado. ( e ) Expresión en la superficie celular de WT y PTH2R mutante evaluada mediante análisis de citometría de flujo. Los símbolos y las barras de error representan la media y el SEM, respectivamente, y los puntos muestran datos individuales de cuatro experimentos independientes, cada uno realizado por duplicado. El análisis estadístico se realizó mediante la prueba t de dos colas. ns, no significativamente diferente entre los grupos.

( a ) Las estructuras TMD de PTH1R unido a PCO371 y seis GPCR unidos a ligando intracelular se muestran paralelas a la membrana o desde el lado intracelular. violeta, PTH1R unido a PCO371; magenta, PCO371; naranja, compuesto 2 unido a GLP-1R; azul, compuesto 2, amarillo, CCR2 unido al receptor de quimiocinas con motivo CC (CCR2)-RA-[R]; violeta, CCR2-RA-[R]; amarillo-verde, cmpd2105-bound CCR7; ciruela, cmpd2105; verde, CCR6 unido a vercirnon; marrón, vercirnon; azul pálido, β2AR unido a cmpd-15PA; coral, cmpd-15PA; cian claro, β2AR unido a cmpd-6FA; oro, cmpd-6FA. (b, c) Estructuras superpuestas de GLP-1R unido al compuesto 2, GLP-1R unido a GLP-1, GLP-1R unido a LY3502970 y GLP-1R inactivo. Blanco, GLP-1 unido a GLP-1; caqui, GLP-1; rojo, GLP-1R unido a LY3502970; azul cielo, LY3502970; gris, GLP-1R inactivo. El compuesto 2 se une a la porción intracelular de TM6, y el GLP-1R unido al compuesto 2 exhibe la misma conformación activa de TM6. ( d ) Respuestas de cAMP de GloSensor en PTH1R de tipo salvaje (WT) y mutantes reemplazados por TM6 con agonistas endógenos (PTH o glucagón) o estimulación con PCO371. Los símbolos y las barras de error representan la media y SEM, respectivamente, de tres experimentos independientes, cada uno realizado por duplicado. ( e ) Vista transversal de PCO371–PTH1R–Gs y vista ampliada de la interfaz de proteína PCO371-G. La región Gαs que interactúa con PCO371 está coloreada de naranja. ( f ) Alineación de secuencia del gancho C-terminal de las proteínas Gα.

( a ) Una vista de sección transversal del PTH1R con destino a PCO371. ( b ) Una vista ampliada de la estructura superpuesta de PTH1R unido a PCO371 (púrpura), GCGR unido a GCG (naranja) y GIPR unido a GIP (gris). ( c ) Comparación estructural de N5.50 de receptores insensibles a PCO371 y receptores sensibles a PCO371, relacionado con la Fig. 4d. violeta, PTH1R unido a PCO371; receptores grises, insensibles a PCO371; naranja, receptores sensibles a PCO371. ( d ) Análisis de trayectoria de tres simulaciones independientes con PTH1R unido a PCO371. Los dos paneles superiores muestran que el PTH1R unido a PCO371 mantiene una conformación activa, parecida a nuestra estructura crio-EM. El segundo panel desde abajo muestra el ángulo diedro de N3745.50. Los ángulos de PTH1R (azul) y GLP-1R (rojo) unidos a PCO371 se muestran como líneas discontinuas. El panel inferior muestra la distancia entre N3745.50-ND2 y PCO371-O1, lo que representa una interacción estable de PCO371 con N3745.50 en un estado intermedio. (e) Conformación distinta de N3745.50 entre PTH1R unido a PCO371 y GLP-1R activo unido a GLP-1 (ID de PDB: 6X18). El ángulo diedro se calcula con los ángulos N–Cα y Cβ–Cγ de N5.50. ( f ) Superposición de nuestra estructura crio-EM (violeta) y una instantánea representativa de la simulación MD de 1,5 µs en la ejecución 2 de PTH1R unido a PCO371 (amarillo). En la simulación, el receptor adoptó una estructura intermedia y PCO371 se movió hacia TM5. ( g ) Comparación de nuestra estructura crio-EM (violeta) y una estructura intermedia (amarilla) observada en la simulación. PCO371 no interactúa con N3745.50 en nuestra estructura crio-EM, mientras que crea una interacción estable con N3745.50 en la simulación. ( h ) acumulación de AMPc de WT y mutante N3745.50A con PTH y PCO371. El mutante N3745.50A redujo selectivamente la respuesta de PCO371. Los símbolos y las barras de error representan la media y SEM, respectivamente, y los puntos muestran datos individuales de tres experimentos independientes, cada uno realizado por duplicado. * y ** representan P < 0,05 y 0,01, respectivamente, con ANOVA de dos vías seguido de la prueba de Dunnett para análisis de comparación múltiple. ns, no significativamente diferente entre los grupos.

( a ) Las estructuras TMD de PCO371–PTH1R–Gs se muestran paralelas a la membrana. (b, c) Corte transversal y vistas ampliadas del TMD. El círculo blanco discontinuo muestra un bolsillo de unión de ligando intracelular que comprende TM1, TM7 y Helix8 (panel izquierdo). La línea discontinua blanca muestra la distancia entre Cβ de Cys7.60 y O6 de PCO371. ( d ) Alineación de secuencia de la región C-terminal después de TM7. El cuadro rojo muestra C4627.60 de PTH1R.

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Reimpresiones y permisos

Kobayashi, K., Kawakami, K., Kusakizako, T. et al. Activación de GPCR de clase B1 por un agonista intracelular. Naturaleza (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-023-06169-3

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Recibido: 26 Septiembre 2022

Aceptado: 04 mayo 2023

Publicado: 07 junio 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-023-06169-3

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