Diseño y caracterización de una red de conmutación de pliegues de proteínas.

Nature Communications volumen 14, Número de artículo: 431 (2023) Citar este artículo

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Para comprender mejor cómo la secuencia de aminoácidos codifica la estructura de la proteína, diseñamos vías mutacionales que conectan tres pliegues comunes (3α, β-grasp y α/β-trenza). Las estructuras de las proteínas en las intersecciones de alta identidad de secuencia en las vías (nodos) se determinaron mediante espectroscopia de RMN y se analizaron en cuanto a estabilidad y función. Para generar nodos, la secuencia de aminoácidos que codifica un pliegue más pequeño se incrusta en la estructura de un pliegue ~50 % más grande y se diseña una nueva secuencia compatible con dos conjuntos de interacciones nativas. Esto genera pares de proteínas con un pliegue de agarre 3α o β en la forma más pequeña, pero un pliegue de trenza α/β en la forma más grande. Además, la inclusión de pliegues antagonistas más pequeños crea estados críticos en los pliegues más grandes, de modo que las sustituciones de un solo aminoácido pueden cambiar tanto su pliegue como su función. Los resultados ayudan a explicar la ambigüedad subyacente en el código de plegamiento de proteínas y muestran que las nuevas estructuras de proteínas pueden evolucionar a través de un cambio de pliegue abrupto.

Ha habido avances notables recientemente en la capacidad de predecir la estructura terciaria de una proteína a partir de su secuencia primaria de aminoácidos1,2, así como en el diseño de secuencias de aminoácidos que codifican estructuras proteicas únicas y estables3. Sin embargo, también está bien establecido que algunas proteínas tienen una propensión a dos conformaciones completamente diferentes, pero bien ordenadas4,5,6,7,8,9,10,11,12. Una mejor comprensión de la ambigüedad del código de plegamiento de proteínas conduciría a una mejor comprensión de cómo evolucionan las proteínas, cómo se relaciona la mutación con la enfermedad y cómo se puede anotar la función en secuencias de estructura desconocida13,14,15,16,17,18, 19,20,21,22,23,24,25,26,27. Si el código de plegamiento de proteínas se entendiera realmente, sería posible predecir y diseñar proteínas que sufran cambios profundos en su conformación. Ha habido un progreso significativo en la comprensión de las proteínas naturales que cambian de pliegues11 y en la predicción de proteínas naturales que cambian de pliegues a partir de datos de secuencias de aminoácidos25. El diseño de proteínas en la interfaz entre diferentes pliegues ha sido posible7,28,29,30 pero aún presenta un desafío formidable. Ha sido particularmente desafiante diseñar proteínas monoméricas que cambien de pliegue sin un cambio en la estructura cuaternaria, y se necesita una mejor comprensión sobre cómo un subconjunto muy limitado de interacciones intraproteicas puede inclinar la balanza de un pliegue y función a otro29,31, 32.

Nuestro objetivo aquí era diseñar proteínas monoméricas que se encuentran en un estado crítico entre dos pliegues distintos. Para hacer esto, elegimos tres pliegues de proteínas bien estudiados y diseñamos una serie de secuencias de modo que cada secuencia sea compatible con dos conjuntos de interacciones nativas. Dos de estos pliegues son de la proteína G estreptocócica que contiene dos tipos de dominios que se unen a proteínas séricas en la sangre: el dominio GA se une a la albúmina sérica humana (HSA)33,34 y el dominio GB se une a la región constante (Fc) de IgG35,36. La tercera proteína es S6, un componente de la subunidad ribosomal 30S de Thermus thermophilus37,38,39,40,41. Para simplificar, el pliegue S6 se conoce como pliegue en S, el pliegue GA como pliegue en A y el pliegue GB como pliegue en B. Estas proteínas no comparten una homología de secuencia significativa y son representativas de tres de los diez pliegues más comunes: el pliegue S es una trenza α/β similar a la tiorredoxina; el pliegue A es un haz de hélice 3α similar a un homeodominio; y el pliegue B es un agarre β similar a la ubiquitina42.

La Figura 1 muestra una red de intersecciones de secuencias de alta identidad (nodos) que conectan los tres pliegues. Las flechas en la Fig. 1 muestran una red que se origina con la secuencia natural S6. Los círculos representan nodos en la red en los que ocurren cambios estructurales y/o funcionales. Los nodos SI y S'I son puntos de ramificación y conducen por caminos de secuencia divergentes, uno que conduce a un nodo con el pliegue A (S/A) y otro a un nodo con el pliegue B (S/B). Las rutas mutacionales que se cruzan conducen de S/A a la proteína GA nativa y de S/B a la proteína GB nativa. En esta intersección (A/B), un pliegue A cambia a un pliegue B.

S6 es la secuencia de origen en el proceso de ingeniería. SI y S'I son nodos separados y son variantes de tamaño de bucle del pliegue en S, ambos con funciones de inhibidor de proteasa. La rama SI de la ruta mutacional conduce a un nodo con la función de unión A-fold y HSA. La rama S'I de la ruta conduce a un nodo con la función de unión de B-fold y IgG. El nodo S/A (círculos azul y rojo) incluye las proteínas Sa1, Sa2, A1 y A2. El nodo S/B (círculo azul y verde) incluye las proteínas Sb3, Sb4, Sb5, B3 y B4. Las rutas A y B se cruzan en un nodo A/B (círculos verde y rojo) en el que los pliegues A y B son casi isoenergéticos y bifuncionales. Las ramas S y S' continúan y se conectan con muchas otras secuencias naturales en la familia de superpliegues de trenzas α/β.

Las proteínas alrededor del nodo A/B se han caracterizado ampliamente en nuestro trabajo anterior29,31,32. Aquí determinamos que tanto GA como GB pueden cambiar a un tercer pliegue (α/β-trenza) y mostramos que estos tres pliegues y cuatro funciones (unión de HSA, unión de IgG, inhibición de proteasa y unión de ARN) pueden conectarse en una red que evita estados desplegados y sin función. Describimos cómo se diseñaron estos nodos, determinamos estructuras clave mediante espectroscopia de RMN y analizamos la estabilidad y la función de unión. La capacidad de diseñar y caracterizar nodos que conectan tres pliegues pequeños comunes sugiere que el cambio de pliegue puede ser una característica intrínseca del código de plegamiento de proteínas y es importante en la evolución de la estructura y función de las proteínas.

La proteína ribosómica S6 es estructuralmente homóloga a los inhibidores de la subtilisina proteasa conocidos como prodominios (Fig. 2a, b)43,44. Los inhibidores de tipo prodominio tienen dos superficies de unión con la proteasa. Una superficie comprende los últimos nueve aminoácidos C-terminales del inhibidor que se unen en la hendidura de unión al sustrato de la proteasa (Fig. 2b). Se forma una segunda superficie más dinámica entre dos hélices de subtilisina y la gran superficie de la hoja β en la topología de trenza α/β del inhibidor (Fig. 2b)45,46,47. Como resultado, la proteína S6 podría convertirse en una proteína inhibidora de subtilisina del mismo pliegue general (denotado SI) reemplazando sus nueve aminoácidos C-terminales con residuos optimizados para unirse en la hendidura de unión al sustrato de la subtilisina. Este reemplazo da como resultado nuevos contactos entre la hoja β del SI y las hélices de la superficie de subtilisina (Fig. 2b).

a Estructura de la proteína S6 (amarillo), ARN (azul claro) y proteínas S15 y S18 (azul) en el ribosoma 30S (PDB 1FKA [https://doi.org/10.2210/pdb1FKA/pdb], ref. 43 ). Los aminoácidos C-terminales de S6 están en magenta. b La subtilisina (trigo) se muestra en complejo con un modelo del inhibidor SI (amarillo). Los nueve aminoácidos C-terminales de SI se muestran en magenta. Estas posiciones se mutaron en S6 nativo para generar afinidad por la subtilisina. El inhibidor de S'I (verde azulado) también se muestra con los bucles alterados en rojo. La subtilisina utilizada en el modelado fue la proteasa específica de RAS diseñada. c La proteína Sa1 (azul y verde) se generó a partir de SI mediante la mutación de las 45 posiciones (las cadenas laterales mutantes se muestran con barras). La eliminación de aminoácidos C-terminales (azul) cambia a Sa1 al pliegue A (verde). d La proteína Sb3 (rosa y cian) se generó a partir de S'I mediante la mutación de las 67 posiciones (las cadenas laterales mutantes se muestran con barras). La eliminación de los aminoácidos C-terminales (cian) o la mutación puntual cambiarán Sb3 a un pliegue B (rosa). e Modelo de Sa2I (verde y azul) unido a subtilisina (trigo). Modelo de A2 (basado en estructura A1) unido a HSA (violeta). El complejo HSA utilizó PDB 2VDB (ref. 50) como plantilla. f Modelo de Sb3 (rosa y cian) unido a subtilisina (trigo). Modelo de B4 (rosa) unido a Fc (menta). El complejo Fc usó PDB 1FCC (ref. 51) como plantilla. La subtilisina utilizada en las mediciones de modelado e inhibición fue la proteasa PDB 6UAO específica de RAS diseñada (ref. 49).

La proteína SI tiene una longitud de 99 aminoácidos y un bucle de 10 residuos entre β2 y β3. Sin embargo, existen muchas variaciones naturales en la longitud de los bucles en la topología conservada de trenzas α/β48. Por lo tanto, también diseñamos una versión de 91 aminoácidos del pliegue S (denominado S'I), que se asemeja a la topología de los inhibidores de prodominio naturales (Fig. 1 complementaria). Específicamente, el inhibidor S'I tiene un bucle más largo que conecta β1 con α1 y un giro más corto que conecta β2 con β3 (Fig. 2b).

Las proteínas SI y S'I se expresaron y purificaron uniéndose a una columna de proteasa49. Los espectros de CD se compararon con la proteína S6 nativa (Fig. 1 complementaria). Las constantes de inhibición (KI) se midieron utilizando una subtilisina proteasa específica de RAS diseñada y el sustrato peptídico QEEYSAM-AMC49. SI y S'I inhiben la proteasa específica de RAS con valores de KI de 200 y 60 nM, respectivamente (Tabla complementaria 1). Los detalles del ensayo de inhibición competitiva se describen en la sección "Métodos". Los resultados demuestran que una proteína ribosómica se puede convertir en un inhibidor de proteasa con una modificación menor (y sin un cambio de pliegue). Además, sin embargo, las proteínas SI y S'I también facilitaron la ingeniería de cambios posteriores a nuevos pliegues y funciones al vincular cada uno de los pliegues S, A y B a funciones de unión fáciles de medir: inhibición de proteasa (S o S' -doblar); Unión HSA (pliegue en A, Fig. 2e)50; y unión de IgG (B-fold, Fig. 2f)51.

En trabajos anteriores, creamos secuencias que pueblan los pliegues A y B al pasar la secuencia A a través del pliegue B, encontrar una alineación prometedora y luego usar la selección de visualización de fagos para reconciliar una secuencia con ambos pliegues29,52, 53. Aquí, el enfoque es conceptualmente similar, excepto que usamos Rosetta54 como una herramienta de diseño computacional para probar mutaciones compatibles en lugar de la visualización de fagos. El proceso de diseño es el siguiente:

Pase la secuencia A o B a través de los tipos de pliegue SI y S'I.

Identificar alineaciones que minimicen el número de interacciones catastróficas.

Diseñe mutaciones para resolver interacciones desfavorables en grupos de 4 a 6 aminoácidos usando Pymol55 y minimice la energía usando Rosetta-Relax54.

Optimice la estabilidad de la proteína en el pliegue S mediante la mutación computacional de aminoácidos en posiciones que no se superponen. Repita la minimización y evaluación de energía con Rosetta-Relax.

Para reducir las incertidumbres involucradas en el diseño computacional, conserve los aminoácidos originales siempre que sea posible.

No hay razón para suponer que este método es óptimo. Solo estamos aplicando un esquema practicable para secuencias de ingeniería compatibles con dos conjuntos de interacciones nativas y luego evaluando la estructura, la estabilidad y la función. Los diseños iniciales se refinaron en función del análisis estructural con RMN, el análisis termodinámico del despliegue y el análisis funcional mediante ensayos de unión, como se describe a continuación. Todas las proteínas diseñadas se expresaron en E. coli y se purificaron hasta la homogeneidad tal como se describe en la sección "Métodos".

La alineación del pliegue A de unión a HSA de 56 aminoácidos con el pliegue SI de 99 aminoácidos y la subsiguiente mutación para resolver interacciones catastróficas produjo candidatos de cambio de baja energía denominados Sa1 y A1. La secuencia exacta de A1 está incrustada en Sa1 en las posiciones 11 a 66, de modo que las hélices α1 están alineadas estructuralmente (Fig. 3a, Fig. 2A complementaria). Sus modelos computacionales finales fueron generados por Rosetta usando la aplicación Relax. El protocolo Relax busca el espacio conformacional local alrededor de una estructura determinada experimentalmente y se usa solo para evaluar si las mutaciones diseñadas tienen interacciones nativas favorables dentro de ese espacio conformacional limitado. Los modelos diseñados de Sa1 y A1 son muy similares en energía en comparación con las respectivas estructuras nativas relajadas (Fig. 3 complementaria y archivos de datos de origen).

una alineación de secuencias de A1 y Sa1, que son 100 % idénticas en la región A de 56 aminoácidos. b Espectros bidimensionales superpuestos de HSQC 1H-15N de Sa1 (negro) y A1 (rojo) con asignaciones de amida de columna vertebral. Los espectros se registraron a 25 y 5 °C, respectivamente. c Conjunto de 10 estructuras CS-Rosetta de energía más baja para A1 (panel izquierdo). Superposición de la estructura A1 (verde) con el pliegue padre GA (naranja) (panel derecho). d Conjunto de 10 estructuras CS-Rosetta de energía más baja para Sa1 (panel izquierdo). Superposición de Sa1 (verde) con el pliegue principal S6 (naranja) (panel derecho). e Dinámica de la columna vertebral en proteínas diseñadas. Gráfico de valores de NOE heteronuclear en estado estacionario de {1H}-15N a 600 MHz frente al residuo para A1 (rojo) y para Sa1 (negro). Cada conjunto de NOEs heteronucleares se obtuvo de un único experimento. Los errores se estimaron en función del nivel de ruido de fondo medido.

En general, la topología de haz helicoidal 3α de A1 es muy similar a la estructura principal de GA de la que se deriva56. Las asignaciones de desplazamiento químico específicas de la secuencia para A1 (Fig. 3b) se utilizaron para calcular una estructura 3D con CS-Rosetta (Fig. 3c, Tabla 1). Nuestros estudios previos indicaron una estrecha correspondencia de CS-Rosetta y estructuras de novo para pliegues A y B con alta identidad de secuencia57. Los residuos N-terminal 1-4 y los residuos C-terminal 53-56 están desordenados en la estructura, de acuerdo con los datos de NOE heteronuclear en estado estacionario {1H}-15N (Fig. 3e). Del mismo modo, Sa1 tiene la misma topología general βαββαβ que la estructura original S6 (Fig. 3d, Tabla 2). Los cambios químicos de la columna vertebral (Fig. 3b) se usaron en combinación con los NOE entre protones de la cadena principal (Fig. 4 complementaria) para determinar una estructura tridimensional utilizando CS-Rosetta (PDB 7MN1). El conjunto conformacional muestra elementos bien definidos de estructura secundaria en los residuos 2–10 (β1), 16–32 (α1), 40–44 (β2), 59–67 (β3), 73–81 (α2) y 86 –92 (β4). La principal diferencia con la estructura nativa es que la hebra β2 es siete aminoácidos más corta en Sa1 que en S6. Los datos de NOE heteronuclear muestran una consistencia general con la estructura, lo que indica que el bucle largo entre las cadenas β2 y β3 de los residuos 45–58 es más flexible que otras regiones internas de la cadena polipeptídica (Fig. 3e).

Aunque la secuencia de 56 aminoácidos de A1 es 100% idéntica a los residuos 11 a 66 de Sa1, una fracción significativa de la columna vertebral sufre cambios entre las dos estructuras. En particular, mientras que las hélices α1 en A1 y Sa1 tienen una longitud similar, las regiones correspondientes a las hélices α2 y α3 de A1 forman las hebras β2 y β3 de Sa1 (Fig. 4a). Los aminoácidos del núcleo en la hélice α1 de A1 se corresponden con residuos que también contribuyen al núcleo de Sa1. Sin embargo, la hélice α1 en Sa1 contacta con un conjunto de residuos casi completamente diferente (Fig. 4b). Por ejemplo, los aminoácidos L51, Y53 e I55 en la cola C-terminal de A1 no tienen un contacto extenso con α1, pero los residuos correspondientes en Sa1 (L61, Y63 e I65) forman interacciones centrales cercanas con α1 como parte de la cadena β3. La mayoría de los otros residuos del núcleo que contactan con la hélice α1 de Sa1 están fuera de la región de 56 aminoácidos que codifica el pliegue A1. Estos incluyen F4, V6, I8 y L10 de la cadena β1; A67 de la cadena β3; V72, L75 y L79 de la hélice α2; y V85 del bucle entre la hélice α2 y la hebra β4. Dos residuos adicionales, V88 y V90 (β4) también contribuyen significativamente al núcleo, pero no entran en contacto con α1. Por lo tanto, a excepción de la alineación topológica original de las hélices α1, los núcleos de los pliegues de la trenza 3α y α/β no se superponen en gran medida. En total, aproximadamente la mitad de los residuos que participan en el núcleo Sa1 no están presentes en la secuencia A1.

a Comparaciones de la cadena principal. (Panel izquierdo) Estructura CS-Rosetta de A1 con código de colores para elementos estructurados secundarios. (Panel derecho) Regiones codificadas por colores correspondientes mapeadas en la estructura CS-Rosetta de Sa1, que ilustran cambios en la conformación de la columna vertebral. Las regiones fuera de la secuencia de 56 aminoácidos de A1 se muestran en el trigo. b Comparaciones de cadenas laterales. (Panel izquierdo) Residuos que contribuyen al núcleo de A1 desde la hélice α1 (amarillo) y desde otras regiones (cian). Los residuos del núcleo que no son α1 de Sa1 (rosa) no se superponen con el núcleo A1 (consulte el texto para obtener más detalles). (Panel derecho) Residuos que contribuyen al núcleo de Sa1 desde la hélice α1 (amarillo) y la mayoría de los demás residuos del núcleo participantes (rosa). Los residuos del núcleo que no son α1 de A1 también se muestran (cian), lo que destaca el bajo grado de superposición.

Se midieron los espectros de CD de UV lejano para Sa1 y A1 y sus perfiles de despliegue térmico se determinaron midiendo la elipticidad a 222 nm frente a la temperatura (Fig. 5 y Fig. 5 complementaria). Sa1 tiene una TM de ~100 °C y un ∆Gplegamiento estimado de -5,3 kcal/mol a 25 °C (Fig. 5b, Tabla complementaria 1)58. El ∆G plegamiento del padre S6 es −8,5 kcal/mol40. La energía de Rosetta del diseño Sa1 es similar a la de la secuencia nativa (Fig. 3 complementaria). A1 tiene una TM de 65 °C y un ∆G plegamiento = −4,0 kcal/mol a 25 °C58 (Fig. 5a, Tabla complementaria 1). El ∆G plegamiento del GA padre es −5,6 kcal/mol59,60. La energía de Rosetta del diseño A1 es ligeramente más favorable que la de la secuencia nativa (Fig. 3 complementaria).

a Gráfico de elipticidad a 222 nm versus temperatura para variaciones A- y B-. b Gráfico de elipticidad a 222 nm versus temperatura para variaciones S. Sb0 es una variante de baja estabilidad (F7V) de Sb1 que se utiliza para medir la dependencia de la temperatura del estado desplegado. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

La ingeniería inicial del interruptor plegable se llevó a cabo sin tener en cuenta la función de preservación. Como resultado, A1 no tiene afinidad de unión HSA detectable porque dos aminoácidos en la interfaz de unión estaban mutados. Sin embargo, se recupera una unión significativa a HSA cuando las mutaciones superficiales, E28Y y K29Y, se realizan en A1 (indicado como A2). Estas mutaciones no parecen afectar la estructura de A1 (Fig. 5 complementaria), pero dan como resultado la unión de HSA de KD ≤ 1 µM (Tabla 1 complementaria). Esto se determinó midiendo la unión a HSA inmovilizada como se describe en la sección "Métodos".

Sa1 no se une a la proteasa porque los aminoácidos C-terminales no se conservaron en su diseño. Sin embargo, se puede convertir en un inhibidor de la proteasa reemplazando sus tres aminoácidos C-terminales (AAD) con DKLYRAL (denominado Sa1I). También se hizo una versión de Sa1I que contiene la secuencia exacta de A2 de 56 aminoácidos al hacer las mutaciones E38Y, K39Y (indicadas como Sa2I). Sa1, Sa1I y Sa2I tienen una estructura similar según el análisis de CD (Fig. 5 complementaria). Se determinó que la constante de inhibición de Sa2I con la subtilisina manipulada era de 50 nM, como se describe en la sección "Métodos" (Tabla complementaria 1). Por lo tanto, un pliegue A estable con función de unión a HSA se puede incrustar dentro de un pliegue S de 99 aminoácidos con función inhibidora de proteasa (Fig. 2c, e). Cabe señalar que todos los aminoácidos de contacto de HSA se conservan en las secuencias A2 y Sa2I, pero la topología tridimensional necesaria para formar la superficie de contacto de HSA se produce solo en el pliegue A50. Sin embargo, se observó que Sa2I se unía débilmente a HSA (KD ~ 100 µM, Tabla complementaria 1). Esta débil afinidad sugiere que algunas moléculas de Sa2I pueden poblar el pliegue 3α aunque el pliegue de la trenza α/β predomine fuertemente.

Al diseñar un cambio de pliegue S a B, utilizamos dos alineaciones topológicas. El primero fue entre los pliegues SI y B, donde se alinearon las cadenas β1 de cada pliegue (Figuras complementarias 2B y 6A). La segunda alineación fue entre los pliegues S'I y B, donde el bucle largo entre β2 y β3 en SI se acortó en S'I para ser más consistente con los inhibidores de proteasa naturales. En este esquema, la topología α1β3β4 del pliegue B se alineó con la topología α1β2β3 del pliegue S'I (Fig. 6a, Fig. 2C complementaria).

a Alineación de secuencias de B4 y Sb3, que difieren en un residuo (L5Y) sobre la región B de 56 aminoácidos. b Espectros bidimensionales superpuestos de HSQC 1H-15N de Sb3 (negro) y B4 (rojo) con asignaciones de amida de columna vertebral. Los espectros se registraron a 25 °C. El pico A56 es una señal con alias. Los picos marcados con un asterisco disminuyen en intensidad relativa a medida que disminuye la concentración de B4, lo que indica la presencia de un dímero putativo asociado débilmente además del monómero. c Conjunto de 10 estructuras CS-Rosetta de energía más baja para B4 (panel izquierdo). Superposición de la estructura B4 (verde) con el pliegue GB principal (naranja) (panel derecho). d Conjunto de 10 estructuras CS-Rosetta de energía más baja para Sb3 (panel izquierdo). Superposición de Sb3 (verde) con el pliegue principal S6 (naranja) (panel derecho). e Gráfico de valores de NOE heteronuclear en estado estacionario de {1H}-15N a 600 MHz frente al residuo para B4 (rojo) y Sb3 (negro). Cada conjunto de NOEs heteronucleares se obtuvo de un único experimento. Los errores se estimaron en función del nivel de ruido de fondo medido.

En el primer enfoque, la alineación de las hebras β1 del pliegue B y el pliegue S y la subsiguiente mutación para resolver interacciones catastróficas produjeron candidatos de cambio de baja energía denominados B1 y Sb1. La secuencia exacta de B1 está incrustada en Sb1 en las posiciones 4–59 (Fig. 6A complementaria). Los modelos computacionales de B1 y Sb1 muestran aumentos de energía relativamente pequeños en comparación con las estructuras nativas relajadas correspondientes (Fig. 3 complementaria). La estructura de RMN de B1 mostró una topología ββαββ idéntica a la del pliegue B principal, con un RMSD de la columna vertebral de ~ 0.6 Å (Fig. 6B, C complementaria). Sin embargo, la topología de Sb1 no es la misma que la estructura principal S6 y, en cambio, tiene un pliegue similar al de B1 (Figuras complementarias 6B, D y 7, PDB 7MQ4). La introducción de 13 mutaciones en Sb1 generó una proteína denominada Sb2 (Fig. 8 complementaria). Sb2 contiene cuatro cadenas β y dos hélices α y tiene las características generales del pliegue S principal (Fig. 9 complementaria, PDB 7MN2). Sin embargo, la versión de 56 aminoácidos de Sb2 (indicada como B2) tiene una energía de Rosetta significativamente más alta que B1 y presumiblemente está desplegada (Fig. 3 complementaria). Por lo tanto, ni los pares de proteínas B1/Sb1 ni B2/Sb2 dieron como resultado secuencias de alta identidad con diferentes pliegues. No obstante, B1 es 80% idéntico a la región incrustada correspondiente en la proteína Sb2 plegada en S (Fig. 9A complementaria). Las estructuras de B1, Sb1 y Sb2 se describen con más detalle en el Suplemento y en las Tablas 1 y 2.

Para mejorar el diseño del interruptor de S a B, alineamos el pliegue B con el pliegue del inhibidor S 'y elegimos una alineación que crea una coincidencia topológica entre α1β3β4 en B y α1β2β3 en S' (Suplementario Fig. 2C). La mutación para resolver las interacciones perjudiciales en esta alineación produjo candidatos de cambio de baja energía denominados B3 y Sb3 (Fig. 10 complementaria). La secuencia exacta de B3 está incrustada en Sb3 en las posiciones 1–56. La energía del modelo computacional para Sb3 es ligeramente más favorable que la estructura nativa relajada. El modelo diseñado de B3 muestra aumentos de energía relativamente pequeños en comparación con la estructura nativa relajada (Fig. 3 complementaria).

La determinación de la estructura basada en RMN indicó que Sb3 tiene una estructura secundaria βαββαβ y una topología de pliegues en S (Fig. 6a, b, d, PDB 7MP7). Las regiones ordenadas corresponden a los residuos 4–10 (β1), 24–37 (α1), 42–46 (β2), 51–56 (β3), 62–70 (α2) y 79–85 (β4). La comparación de Sb3 con el pliegue S original indica que la porción β1/α2/β4 del pliegue es similar en ambos. Por el contrario, el bucle β1–α1 es más largo en Sb3 (13 residuos) que en el pliegue en S original (5 residuos), mientras que α1, β2, el bucle β2–β3 y β3 son todos más cortos que en el padre (Fig. .6d). De acuerdo con la estructura de Sb3, el bucle β1-α1 de 13 aminoácidos es muy flexible (Fig. 6e). También expresamos y purificamos una proteína truncada correspondiente al pliegue B incrustado, la versión de 56 aminoácidos de Sb3 (indicada como B3). El espectro 2D 1H-15N HSQC de B3 a 5 °C y bajas concentraciones (<20 μM) fue consistente con un pliegue B monomérico predominante (Fig. 11 complementaria), pero mostró una ampliación de intercambio significativa a 25 °C, indicativo de baja estabilidad (ver abajo). Presumiblemente, la baja estabilidad se debe al empaquetamiento menos favorable de Y5 en el núcleo del pliegue B en comparación con una leucina alifática más pequeña. Sin embargo, también estaban presentes especies adicionales, supuestamente oligoméricas, para las cuales las intensidades máximas relativas aumentaron con el aumento de la concentración de proteína. Debido a su estabilidad relativamente baja y la heterogeneidad de la muestra, B3 no se analizó más estructuralmente.

Utilizamos la estructura de RMN de Sb3 para diseñar una mutación puntual, tirosina 5 a leucina (Y5L), que estabilizaría el pliegue B incrustado sin comprometer los contactos nativos en el pliegue S (Figura 10 complementaria). Por lo tanto, se esperaba que este mutante cambiara la población al doblez B. Se prepararon dos mutantes, un mutante Y5L de Sb3 (denominado Sb4) y un mutante Y5L de B3 (denominado B4). B4, de hecho, es más estable que B3 (Fig. 5a, Tabla complementaria 1). La determinación de la asignación y la estructura de B4 mostró que su topología era idéntica al pliegue B principal (Fig. 6b, c). A concentraciones superiores a 100 μM, B4 mostró una tendencia a una autoasociación débil similar a la observada para B3. Para Sb4, el espectro HSQC exhibió aproximadamente el doble de picos cruzados de amida en relación con Sb3 (Fig. 7a), lo que sugiere que los estados S y B se poblaron simultáneamente. Esto fue confirmado por la asignación de RMN y también por una comparación de los espectros HSQC para Sb4, B4 y Sb3. Una fracción significativa de las señales de amida de la columna vertebral de Sb4 (~ 50 picos) coincidieron estrechamente con las de B4, lo que indica la presencia de un estado B (Fig. 12A-C complementaria). La coincidencia cercana de estos picos se debe presumiblemente a que los residuos 1–56 en el estado B de Sb4 son idénticos en secuencia a B4. Las perturbaciones de cambio de amida más grandes entre el estado B de Sb4 y B4 ocurren para los residuos próximos al extremo C del pliegue B, como G41, donde Sb4 tiene residuos adicionales y B4 no. Muchas de las señales de Sb4 también coincidieron bien con Sb3, aunque el grado de similitud no fue tan extenso como con B4 (Fig. 12D-F complementaria). Es probable que las diferencias de cambio químico de amida más significativas entre el estado S de Sb4 y Sb3 se deban a la mutación Y5L, que es un cambio relativamente grande ubicado adyacente al núcleo. Para resolver estas ambigüedades, se realizaron asignaciones de resonancia de columna vertebral para el estado S de Sb4 (Fig. 7a, [https://doi.org/10.13018/BMR51719], consulte la sección "Métodos" para obtener más detalles). La comparación de las asignaciones de estado S de Sb4 con Sb3 indicó que la mayoría de las perturbaciones de cambio de amida más grandes estaban en las hebras β1 y β4. El análisis de desplazamiento secundario mostró que el patrón de elementos de estructura secundaria para el estado S de Sb4 es similar al de Sb3 (Fig. 7b). El análisis NOE entre protones indicó que la disposición de las cadenas β también es similar (Fig. 7c). Juntos, estos resultados muestran que Sb4 puebla los pliegues S y B aproximadamente por igual a 25 °C. Además, un espectro de intercambio ZZ demostró que los estados S y B de Sb4 están en un intercambio conformacional lento en la escala de tiempo de RMN (Fig. 7d).

a Espectros bidimensionales de HSQC 1H–15N de Sb4 (izquierda), B4 (centro) y Sb3 (derecha) a 25 °C. En el espectro de Sb4, se muestran las asignaciones de resonancia de amida de la columna vertebral para el estado S (azul) y el estado B (rojo). b Niveles de confianza de regiones de estructura secundaria ordenadas para el estado S de Sb4 a 30 °C (rojo) y para Sb3 a 25 °C (gris) a partir de cambios químicos utilizando TALOS-N. Los elementos de la estructura secundaria de Sb3, determinados a partir de la estructura tridimensional, se muestran arriba del gráfico. c Resumen de los NOE troncales de largo alcance a partir de datos 3D 15N-NOESY para Sb3 a 25 °C (negro) y el estado S de Sb4 a 30 °C (rojo). d Región Gly41 del espectro de intercambio ZZ de 300 ms para Sb4 a 25 °C, que muestra picos de intercambio entre los estados S y B.

Finalmente, diseñamos una mutación de leucina 67 a arginina (L67R) en Sb4 para desestabilizar el pliegue S sin cambiar la secuencia del pliegue B incrustado. El mutante se indica como Sb5 (Fig. 10 complementaria). Se esperaba que esto cambiara la población al doblez B. El espectro 2D 1H-15N HSQC de Sb5 indica que la mutación L67R de hecho desestabiliza el pliegue S, con la pérdida de picos cruzados de amida de tipo S y la aparición simultánea de un nuevo conjunto de señales que indican un cambio a un B- doblar. La superposición del espectro de Sb5 con el de B4 muestra que las nuevas señales en Sb5 se corresponden en gran medida con el espectro de B4 (Fig. 13 complementaria). Por lo tanto, la mutación L67R cambia el equilibrio del pliegue S al pliegue B. Las señales adicionales (~25–30) en la región central del espectro HSQC que no se detectan en B4 se deben presumiblemente a la cola C-terminal desordenada de Sb5. La cola C-terminal de Sb5 no parece interactuar ampliamente con el pliegue B, como lo demuestran los pocos cambios en los cambios químicos o las intensidades máximas en la región B de Sb5 en comparación con B4.

Los aminoácidos alineados 1–56 de Sb3 y B4 tienen una identidad de secuencia del 98 %, siendo la única diferencia una mutación L5Y en Sb3 (Fig. 6a). Sin embargo, los pliegues globales de Sb3 y B4 tienen diferencias a gran escala (Fig. 8a, Fig. 4 complementaria). Las hebras β1, aunque de longitud similar, están en direcciones opuestas en Sb3 y B4. La cadena β1 forma una interacción de cadena paralela con β4 en B4, pero una interacción antiparalela con la cadena β3 correspondiente en Sb3. Mientras que los residuos 9-20 forman el giro β1-β2 de 6 residuos y la hebra β2 de 6 residuos de B4, estos mismos aminoácidos constituyen el final de β1 y 10 residuos del bucle β1-α1 en gran medida desordenado en Sb3. El resto de la región B es topológicamente similar, con la estructura α1/β3/β4 en B4 que coincide con la estructura α1/β2/β3 en Sb3. En general, sin embargo, el orden de los enlaces H en las hojas β de 4 hebras es bastante diferente, con β2β3β1β4 en Sb3 y β3β4β1β2 en B4.

a Comparaciones de la cadena principal. (Panel izquierdo) Estructura CS-Rosetta de B4 con elementos de estructura secundaria codificados por colores. (Panel derecho) Regiones codificadas por colores correspondientes mapeadas en la estructura CS-Rosetta de Sb3, que muestran cambios en la conformación de la columna vertebral. Las regiones fuera de la secuencia de 56 aminoácidos de B4 se muestran en el trigo. b Comparaciones de cadenas laterales. (Panel izquierdo) Residuos que contribuyen al núcleo de B4 de α1/β3/β4 (amarillo) y de otras regiones (cian). Los residuos del núcleo que no son α1/β2/β3 de Sb3 (rosa) no se superponen con el núcleo B4 (consulte el texto para obtener más detalles). (Panel derecho) Residuos que contribuyen al núcleo de Sb3 de α1/β2/β3 (amarillo) y los otros residuos del núcleo participantes (rosa). Los residuos centrales que no son α1/β2/β3 de B4 también se muestran (cian). Se resalta la única diferencia de aminoácido L5Y entre B4 y Sb3.

Los residuos centrales principales de B4 consisten en Y3, L5, L7 y L9 de β1, A26, F30 y A34 de α1 y F52 y V54 de β4 (Fig. 8b). En Sb3, las regiones topológicamente equivalentes del núcleo son A26, F30 y A34 de α1, y F52 y V54 de β3. Los residuos Y5, L7 y L9 de la hebra β1 de Sb3 también forman parte del núcleo, pero con un relleno diferente al de B4 debido a la orientación inversa de β1. Los residuos A12 y A20, que contribuyen a la periferia del núcleo en B4, son solventes accesibles en el bucle β1-α1 de Sb3. La mayoría de los residuos centrales restantes de Sb3 provienen de fuera de la región B e incluyen aminoácidos de β3 (A56), α2 (V64, L67, A68, L71) y β4 (V80 e I82).

Se midieron los espectros de CD de UV lejano para B3, B4, Sb3, Sb4 y Sb5 y sus perfiles de despliegue térmico se determinaron midiendo la elipticidad a 222 nm frente a la temperatura (Fig. 5, Fig. 10 complementaria, Tabla complementaria 1). Como se describió anteriormente, la forma predominante de Sb3 es un pliegue en S. Los análisis de CD y RMN muestran que B3 es predominantemente un pliegue B con un ∆Gplegamiento de −1,2 kcal/mol a 25 °C58. Del análisis de RMN, parece que el pliegue B está en equilibrio con estados supuestamente diméricos. Esto crea una situación en la que el pliegue B depende tanto de la temperatura como de la concentración. Sin embargo, la forma predominante a 5 °C y ≤18 µM es el pliegue B. La baja estabilidad y el comportamiento dependiente de la concentración de B3 pueden indicar que podría persistir cierta propensión a las conformaciones de tipo S en la proteína de 56 residuos.

Sb4 tiene un perfil de despliegue de temperatura muy similar a Sb3 (Fig. 5), aunque tanto S- como B- están aproximadamente igualmente poblados a 25 °C en Sb4 (Fig. 7). Esto muestra que la mutación Y5L da como resultado dos pliegues que son casi isoenergéticos y termodinámicamente estables en relación con el estado desplegado. Además, debido a que los pliegues S y B están en equilibrio y aproximadamente igualmente poblados, la energía libre de cambiar al pliegue B desde el pliegue S (∆GB-pliegue/S-pliegue) es ~0 kcal/mol a 25 ºC El equilibrio del interruptor refleja la influencia del pliegue B antagónico en la población del pliegue S en Sb4, donde la leucina en el residuo 5 ayuda a estabilizar el estado B alternativo a expensas del estado S. La desnaturalización térmica por CD muestra que B4 tiene un ∆G plegamiento = −4,1 kcal/mol a 25 °C58. El perfil de despliegue térmico de Sb5 muestra una transición de baja temperatura con un punto medio de ~10 °C y una transición importante con un punto medio de ~60 °C (Fig. 5b). El análisis de RMN indica que la transición principal es el desarrollo del pliegue B. Por lo tanto, la arginina en 67 en Sb5 hace que el pliegue B sea más favorable al hacer que el pliegue S sea desfavorable, de acuerdo con el cambio en la población de mixto a pliegue B observado por RMN.

La proteína Sb3 está estrechamente relacionada con S'I pero carece de función inhibidora porque los aminoácidos C-terminales se cambiaron en el diseño del interruptor. Sin embargo, se puede convertir en un inhibidor de la proteasa alterando los aminoácidos C-terminales VTE a DKLYRAL. Este mutante se denomina Sb3I. Sb3 y Sb3I parecen similares en estructura por análisis de CD (Fig. 10 complementaria). Se determinó que el KI para Sb3I con la subtilisina modificada era de 50 nM (Tabla complementaria 1).

Se determinó la unión a IgG para B3 y Sb3I (Tabla complementaria 1). B3 y Sb3I se unieron a IgG Sepharose con KD ≤ 1 µM y 10 µM, respectivamente. Presumiblemente, Sb3I tiene una actividad de unión a IgG significativa porque la superficie de unión de IgG α1β3 del pliegue B se conserva en gran medida en el pliegue S. Por lo tanto, Sb3I es una proteína de función dual con funciones inhibidoras de la proteasa y de unión a IgG (Fig. 2f).

La red completa de vías de intersección entre los pliegues S, A y B se resume en la Fig. 9. El primer nodo de la vía es un cambio funcional de la proteína de unión al ARN al inhibidor de la proteasa sin un cambio de pliegue. La trenza α/β es un pliegue común, y las proteínas con esta topología básica incluyen muchas funciones diferentes42. La ingeniería de los nodos SI y S'I ilustra cómo puede surgir la función del inhibidor de la proteasa en la topología de la trenza α/β con algunas mutaciones. Reemplazar solo los aminoácidos C-terminales en la proteína S6 crea una interacción con la hendidura de unión al sustrato de la proteasa (Fig. 2a, b). Esta interacción C-terminal más el contacto accidental entre la superficie de la hoja β de la trenza α/β y dos hélices α en la proteasa dan como resultado la inhibición de la proteasa en el rango de 50 nM. Según la estructura de S6 en el complejo 30S, es posible que la modificación del extremo C no tenga efectos importantes en las interacciones de unión con el ARN ribosómico y la proteína S15 (Fig. 2a)43. Por lo tanto, es probable que la transición de la proteína de unión al ARN al inhibidor de la proteasa no se interrumpa. Una inserción en el bucle β1–α1 y un bucle de eliminación β2–β3 en el inhibidor SI crea una topología que se parece más a los inhibidores naturales de tipo prodominio44,46,61 y crea un motivo α1β2β3 en el pliegue en S que es similar al motivo α1β3β4 del pliegue B. Esta similitud topológica acerca el S'I a una intersección con el pliegue B. Por lo tanto, los nodos SI y S'I son interruptores funcionales y puntos de bifurcación para cambiar el pliegue S en los pliegues A y B, respectivamente.

Los cambios entre pliegues estables pueden ser inducidos por una mutación de un solo aminoácido o por la eliminación o adición de una secuencia terminal que estabiliza el pliegue en S. El azul indica un pliegue en S, el verde un pliegue en B y el rojo un pliegue en A. Las flechas grises conectan proteínas que han sido rediseñadas sin un interruptor de pliegue. Sb4 se observa con dos pliegues simultáneamente. Las estructuras GA98 y GB98 son de los códigos PDB 2LHC y 2LHD (ref. 32), respectivamente.

Los nodos de ingeniería en las intersecciones de los pliegues requerían diseñar secuencias que fueran compatibles con las interacciones nativas en dos pliegues diferentes. Usamos reglas simples para hacer esto. La primera regla era alinear topologías en lugar de maximizar las similitudes de secuencia. Identificar una topología común puede ayudar a determinar un registro que tenga menos conflictos irreconciliables. Por ejemplo, la alineación topológica de la hélice α1 del pliegue SI y la hélice α1 del pliegue A facilitó la ingeniería del interruptor de pliegue, porque las regiones que flanquean α1 del pliegue SI pueden codificar dos motivos de pliegue diferentes. Cuando la alineación topológica es deficiente, como fue el caso de los pliegues en S y B, fue útil buscar variaciones naturales en los giros del pliegue más largo para crear una mejor alineación. La variación en bucles y giros en un pliegue más grande crea más libertad de diseño y una mayor probabilidad de cambios. Una vez que se elige una alineación, la regla básica para resolver conflictos catastróficos es conservar los aminoácidos originales cuando sea posible. Esto reduce las incertidumbres involucradas en el diseño computacional. La función de energía de Rosetta no se usó para predecir una alineación favorable, pero fue importante en la evaluación de mutaciones para resolver conflictos una vez que se eligió una alineación.

La selección de mutaciones compatibles con dos conjuntos de interacciones nativas requirió compensaciones en la energía del estado nativo de cada plegamiento individual5,11. Se puede producir un nodo en los casos en que ambos pliegues alternativos sean estables en relación con el estado desplegado. La estabilidad relativa al estado desplegado (es decir, un estado con poca estructura secundaria) se determinó por fusión de CD (Fig. 5). Fue informativo examinar la estabilidad de las formas tanto cortas (56 residuos) como largas de una supuesta secuencia de nodos. La estabilidad independiente del pliegue en G se puede determinar en la forma corta sin el antagonismo del pliegue en S que está presente en la secuencia más larga. Las estabilidades de las proteínas A1 y A2 son de aproximadamente −4 kcal/mol a 25 °C58 en comparación con −5,6 kcal/mol de la proteína GA nativa56. Las estabilidades de B3 y B4 son −1,2 y −4,1 kcal/mol, respectivamente, a 25 °C58 en comparación con −6,7 kcal/mol para la proteína GB nativa62. Para las secuencias más largas, el ∆G plegamiento de Sa1 y Sb3 es −5,3 y −3,5 kcal/mol, respectivamente, a 25 °C58 en comparación con −8,5 kcal/mol para la proteína S6 nativa40.

Sin embargo, en el caso de los pliegues en S, también se deben considerar los efectos energéticos del pliegue en G integrado y estable. Dado que los equilibrios entre ambos estados plegados y desplegados están vinculados termodinámicamente, la energía libre de un cambio a un pliegue G desde un pliegue S (∆GG-pliegue/S-pliegue) se aproxima por la diferencia en ∆Gplegamiento ( ∆∆Gfolding) entre las formas corta y larga de una proteína de nodo. Por ejemplo, según el ∆Gplegamiento de A1 y Sa1, el ∆GA-pliegue/S-pliegue previsto de Sa1 es 1,3 kcal/mol. Esto es consistente con la estructura del pliegue S predominante determinado por RMN pero también con la pequeña población de pliegue 3α sugerida por la unión débil de HSA. A partir de los perfiles de desnaturalización térmica de B3 y Sb3, el ∆GB-fold/S-fold previsto de Sb3 es de 2,3 kcal/mol, un valor consistente con el S-fold estable observado en los experimentos de RMN. Sin embargo, la secuencia Sb3 también se está acercando a un punto crítico. Una sustitución en Sb3 que estabiliza el pliegue B (Y5L) cambia el equilibrio de Sb4 a una mezcla aproximadamente igual de pliegues B y S. Es decir, ∆GB-fold/S-fold de Sb4 es ~0 kcal/mol a 25 °C. Una sustitución adicional que desestabiliza el pliegue S (L67R) cambia la población de Sb5 a un pliegue B estable (∆GB-pliegue/S-pliegue ≤ −5 kcal/mol) (Fig. 9).

La existencia de nodos entre pliegues tiene implicaciones para la evolución de nuevas funciones. En el caso del nodo S/A, todos los aminoácidos de contacto para HSA existen dentro del pliegue S del inhibidor de proteasa Sa2I, aunque en una topología críptica. La eliminación de los aminoácidos 67–99 (A2) da como resultado la pérdida de la función del inhibidor y un cambio gradual de la trenza α/β a 3α. La adquisición de la actividad de unión a HSA (KD < 1 µM) resulta del desenmascaramiento de los aminoácidos de unión a HSA crípticos a través del interruptor de pliegue (Fig. 2e). Este nivel de afinidad de unión podría ser biológicamente relevante ya que la concentración de HSA en suero es >500 µM63. En el caso del nodo S/B, el motivo α1β3 contiene todos los aminoácidos de contacto de IgG y Sb3I tiene cierta afinidad tanto por IgG (KD = 10 µM) como por proteasa (KI = 50 nM). En este caso, la mutación Y5L (Sb4) o una deleción de 57–91 (B4) provoca un cambio de pliegue de la trenza α/β al agarre β y da como resultado una unión de IgG más estrecha (KD ≤ 1 µM) (Fig. 2f ). Este nivel de afinidad de unión también podría ser biológicamente relevante ya que la concentración de IgG en suero es >50 µM (o >100 µM de sitios de unión a Fc)64. Hemos demostrado previamente que un pliegue A con función de unión a HSA se puede cambiar a un pliegue B con función de unión a IgG a través de sustituciones de un solo aminoácido que cambian los pliegues y desenmascaran los aminoácidos de contacto crípticos para los dos ligandos29,32.

En conclusión, fue posible conectar tres pliegues comunes en una red de nodos de alta identidad que forman puntos críticos entre dos pliegues. Como en otros sistemas complejos, un pequeño cambio en una proteína cerca de un punto crítico puede tener un "efecto mariposa" sobre cómo se pueblan los pliegues. Esta propiedad del código de plegamiento de proteínas significa que las proteínas con múltiples pliegues y funciones pueden existir en secuencias de aminoácidos muy idénticas. Esto sugiere que la evolución de nuevos pliegues y funciones a veces puede seguir rutas mutacionales ininterrumpidas.

La mutagénesis se llevó a cabo utilizando los kits de mutagénesis dirigida al sitio Q5® (NEB). Las variantes GA y GB se clonaron en un vector (pH0720) que codifica la secuencia:

MEAVDANSLA QAKEAAIKEL KQYGIGDKYI KLINNAKTVE GVESLKNEIL KALPTEGSGN TIRVIVSVDK AKFNPHEVLG IGGHIVYQFK LIPAVVVDVP ANAVGKLKKM PGVEKVEFDH QYRGL

como un dominio de fusión N-terminal56. El crecimiento celular se realizó por autoinducción29,65. Las células se recolectaron mediante centrifugación a 3750 × g durante 20 min y se lisaron mediante sonicación en hielo en KPi 0,1 M, pH 7,2. Los desechos celulares se sedimentaron por centrifugación a 10.000 × g durante 15 min. El sobrenadante se aclaró por centrifugación a 45.000 × g durante 30 min. Las proteínas se purificaron utilizando una segunda generación del sistema de etiqueta de escisión por afinidad empleado anteriormente para purificar las proteínas interruptoras29,66. La etiqueta de segunda generación da como resultado una expresión soluble de alto nivel de las proteínas interruptoras y también permite la captura de la proteína de fusión al unirse estrechamente a una proteasa de procesamiento inmovilizada a través de la secuencia EFDHQYRGL C-terminal. La carga y el lavado se realizaron a 5 ml/min para una columna Im-Prot de 5 ml utilizando un tampón de funcionamiento de KPi 20 mM, pH 6,8. La cantidad de lavado requerida para una alta pureza depende de la pegajosidad de la proteína objetivo y de la cantidad que se une a la columna. Por lo general, lavamos con 10 volúmenes de columna (CV) de solución de lavado seguido de 3 CV de NaCl 0,5 M y luego ~10 CV de tampón de ejecución. Esto se puede repetir según sea necesario. Las inyecciones de NaCl 0,5 M se repiten hasta que la cantidad de absorbancia liberada con cada inyección alta en sal se vuelve pequeña y constante. Toda la solución con alto contenido de sal se lava antes de iniciar la escisión. La proteína diana se escindió de la columna Im-Prot inyectando 15 ml de solución de imidazol (0,1 mM) a 1 ml/min, 22 °C. La proteína escindida típicamente eluye como un pico agudo en 2–3 CV. Luego, la proteína purificada se concentró a 0,2–0,3 mM, según lo requerido para el análisis de RMN. Las columnas se regeneraron inyectando 15 mL de H3PO4 0,1 N (0,227 mL de ácido fosfórico concentrado (85%) por 100 mL) a un caudal de ~1 CV/min. La solución de lavado se neutralizó inmediatamente después de la extracción. El sistema de purificación está disponible en Potomac Affinity Proteins.

Las proteínas inhibidoras de la proteasa se purificaron mediante la unión a medios Im-Prot y luego eliminando el inhibidor purificado con H3PO4 0,1 N. A continuación, las muestras se neutralizaron inmediatamente mediante la adición de 1/10 de volumen de K2HPO4 1 M.

Las energías de Rosetta de todas las estructuras diseñadas se generaron utilizando la rutina Slow Relax54. Se calcularon 1000 señuelos para cada diseño. Las coordenadas PDB y los parámetros de energía para el señuelo de menor energía para cada diseño se incluyen como archivos complementarios.

Las mediciones de CD se realizaron en KPi 100 mM, pH 7,2 con un espectropolarímetro Jasco, modelo J-1100 con un controlador de temperatura Peltier. Se utilizaron células de cuarzo con longitudes de paso de 0,1 y 1 cm para concentraciones de proteína de 3 y 30 µM, respectivamente. Los resultados de elipticidad se expresaron como elipticidad residual media, [θ], grados cm2 dmol−1. Las elipticidades a 222 nm se controlaron continuamente a una velocidad de exploración de 0,5°/min. La reversibilidad de la desnaturalización se confirmó comparando los espectros de CD a 20 °C antes de la fusión y después de calentar a 100 °C y enfriar a 20 °C.

La afinidad de las proteínas por HSA e IgG se determinó por su retención en los ligandos inmovilizados. Se inmovilizaron HSA e IgG de conejo por reacción con Sepharose 4 Fast Flow (Cytiva) activado por NHS de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La concentración de HSA inmovilizada fue de 100 µM. La concentración de IgG inmovilizada fue de 50 µM (es decir, 100 µM de sitios de unión a Fc). En general, se inyectaron 0,2 ml de una solución 5 µM de la proteína de prueba en una columna de 5 ml a un caudal de 0,5 ml/min. La determinación de la afinidad de unión supone que la unión se encuentra en un equilibrio rápido, de modo que el volumen de elución es proporcional a la fracción de proteína de prueba unida a 100 µM de sitios de unión. Se evalúa que las proteínas que se retienen por completo después de 20 volúmenes de columna (CV) tienen KD ≤ 1 µM. Las proteínas completamente retenidas se eliminan de la columna con H3PO4 0,1 N al final de la serie.

Las constantes de inhibición competitiva (KI) se determinaron utilizando el sustrato peptídico fluorogénico QEEYSAM-AMC (7-amino-4-metilcumarina) adquirido de AnaSpec Inc. y una proteasa diseñada altamente específica conocida como RASProtease(I)49. Las constantes de inhibición competitiva (KI) se midieron determinando la KM (aparente) en presencia de 0, 50 y 100 nM de cada proteína inhibidora. Las reacciones se llevaron a cabo en KPi 100 mM, imidazol 10 mM, tween-20 al 0,005 %, pH 7,0 a 25 °C con RASProtease(I) 1 nM. Las concentraciones de QEEYSAM-AMC utilizadas para determinar KM y KM (aparente) fueron 0,1, 0,5, 1, 2, 5 y 10 µM. Las tasas iniciales se determinaron con un lector de microplacas de fluorescencia BioTek Synergy MT (Ej: 360/40, Em: 460/40) midiendo la liberación del grupo AMC fluorescente mediante hidrólisis del enlace amida. Se utilizaron proteasas altamente puras (≥98%) y proteínas inhibidoras para todos los experimentos cinéticos.

Las muestras marcadas con isótopos se prepararon en concentraciones de 0,2 a 0,3 mM en tampón de fosfato de potasio 100 mM (pH 7,0) que contenía D2O al 5 %. Los espectros de RMN se recogieron utilizando el software Topspin3.6.1 en espectrómetros Bruker AVANCE III 600 y 900 MHz equipados con criosondas de triple resonancia 1H/13C/15N de gradiente Z. Se utilizaron experimentos de resonancia doble y triple estándar (HNCACB, CBCA(CO)NH, HNCO, HN(CA)CO y HNHA) para determinar las asignaciones de RMN de la cadena principal. Las distancias entre protones se obtuvieron a partir de espectros NOESY editados con 15N en 3D y NOESY editados con 13C en 3D con un tiempo de mezcla de 150 ms. NmrPipe67 se utilizó para el procesamiento de datos y el análisis se realizó con Sparky68. Se adquirieron experimentos de NOE heteronuclear de estado estacionario bidimensional {1H}-15N con un retraso de relajación de 5 s entre experimentos. Los errores en los NOE heteronucleares se estimaron en función del nivel de ruido de fondo. Las perturbaciones de desplazamiento químico se calcularon utilizando Δδtotal = ((WHΔδH)2 + (WNΔδN)2)1/2, donde WH es 1, WN es 0,2 y ΔδH y ΔδN representan cambios de desplazamiento químico de 1H y 15N, respectivamente. Para los experimentos PRE en Sb1, las muestras mutantes de cisteína de un solo sitio se incubaron con 10 equivalentes de (1-oxil-2,2,5,5-tetrametilpirrolina-3-metil)metanotiosulfonato (MTSL), Santa Cruz Biotechnology) a 25 °C durante 1 hy la finalización del marcaje se confirmó mediante espectrometría de masas MALDI. Las muestras de control se redujeron con 10 equivalentes de ascorbato de sodio. Las intensidades de los picos de amida de la columna vertebral de los estados oxidado y reducido se analizaron usando Sparky. Las estructuras tridimensionales se calcularon con CS-Rosetta3.2 utilizando las restricciones de desplazamiento químico de la columna vertebral experimental 15N, 1HN, 1Hα, 13Cα, 13Cβ y 13CO y se validaron por comparación con los patrones NOE de la columna vertebral experimental (A1, B1, B4, Sb1) o NOEs de interprotones empleados directamente (Sa1, Sb2) o PREs (Sb1) como restricciones adicionales. Se calcularon mil estructuras CS-Rosetta a partir de las cuales se eligieron las 10 estructuras de menor energía. Para Sb3, CS-Rosetta no logró converger a una topología única de baja energía, produciendo una mezcla aproximadamente uniforme de pliegues de tipo S y B a pesar de los cambios químicos y el patrón NOE que indica un pliegue en S. En este caso, se empleó CNS1.169 para determinar la estructura56, incluidas las restricciones diédricas de la columna vertebral de los datos de desplazamiento químico utilizando TALOS-N70. Las resonancias de la columna vertebral para el estado S de Sb4 se asignaron utilizando métodos de triple resonancia como se indicó anteriormente, en condiciones en las que el estado S está más poblado (30 °C, KPi 100 mM, cloruro de sodio 200 mM, pH 7,0). A continuación, las asignaciones de amida se transfirieron al espectro HSQC 1H-15N bidimensional de Sb4 a 25 °C en KPi 100 mM, pH 7,0. Los NOE entre protones para el estado S de Sb4 se obtuvieron a 30 °C/condición alta en sal, empleando un espectro NOESY editado con 15N en 3D con un tiempo de mezcla de 150 ms. Se registró un espectro bidimensional de HSQC 1H–15N de intercambio ZZ en Sb4 utilizando un tiempo de mezclado de 300 ms (25 °C, 100 mM KPi, pH 7,0)71,72. Las estructuras de proteínas se visualizaron y analizaron utilizando PROCHECK-NMR73, MOLMOL74 y PyMol (Schrodinger)55.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Las estructuras de RMN generadas en este estudio han sido depositadas en el PDB: [https://doi.org/10.2210/pdb7MN1/pdb]; [https://doi.org/10.2210/pdb7MQ4/pdb]; [https://doi.org/10.2210/pdb7MN2/pdb]; [https://doi.org/10.2210/pdb7MP7/pdb]; [https://pdb-dev.wwpdb.org/entry.html?PDBDEV_00000083]; [https://pdb-dev.wwpdb.org/entry.html?PDBDEV_00000084]; [https://pdb-dev.wwpdb.org/entry.html?PDBDEV_00000085]. Las asignaciones de RMN se han depositado en la BMRB: [https://doi.org/10.13018/BMR30901]; [https://doi.org/10.13018/BMR30902]; [https://doi.org/10.13018/BMR30904]; [https://doi.org/10.13018/BMR30905]; [https://doi.org/10.13018/BMR50907]; [https://doi.org/10.13018/BMR50909]; [https://doi.org/10.13018/BMR50910]; [https://doi.org/10.13018/BMR51719]. Las estructuras a las que se hace referencia en este documento están disponibles públicamente en el PDB: [https://doi.org/10.2210/pdb1FKA/pdb]; [https://doi.org/10.2210/pdb2VDB/pdb]; [https://doi.org/10.2210/pdb1FCC/pdb]; [https://doi.org/10.2210/pdb6UAO/pdb]; [https://doi.org/10.2210/pdb2LHC/pdb]; [https://doi.org/10.2210/pdb1RIS/pdb]. Los datos de origen se proporcionan con este documento. Los modelos de diseño se proporcionan como archivos en los datos de origen. Los datos de origen se proporcionan con este documento.

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Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud Grant GM62154 (a PB y JO) y 5R44GM126676 (a PB). La instalación de RMN cuenta con el apoyo de la Universidad de Maryland, el Instituto Nacional de Estándares y Tecnología y una subvención de la Fundación WM Keck. También agradecemos a los Dres. Nese Sari y Louisa Wu por la lectura crítica del manuscrito y por sus valiosos comentarios. La mención de productos comerciales no implica recomendación o respaldo por parte del NIST.

Estos autores contribuyeron por igual: Biao Ruan, Yanan He, Yingwei Chen.

Proteínas de afinidad de Potomac, 11305 Dunleith Pl, North Potomac, MD, 20878, EE. UU.

Biao Ruan, Yingwei Chen, Eun Jung Choi, Dana Motabar, Richard Simmerman y Philip N. Bryan

Instituto de Investigación en Biociencia y Biotecnología, Universidad de Maryland, 9600 Gudelsky Drive, Rockville, MD, 20850, EE. UU.

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D. Travis Gallagher

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Diseño de proteínas: Yw.C., BR, EC, JO, PB; Realizó análisis termodinámicos y vinculantes: BR, Yw.C., DM, RS, PB; Realizó experimentos dinámicos de dispersión de luz: TG; Experimentos de RMN realizados/análisis estructural: YH, Yh.C., TS, TK, JO; Escribió el artículo: JO (RMN y análisis estructural), Yw.C., BR, PB (secciones restantes).

Correspondencia a John Orban o Philip N. Bryan.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Reimpresiones y permisos

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Recibido: 14 julio 2022

Aceptado: 13 de enero de 2023

Publicado: 26 enero 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-36065-3

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